陳淑吟++陸勤勤+張美如+許廣平+陳國耀

摘要：利用ISSR標(biāo)記擴(kuò)增分析多個(gè)紫菜絲狀體種質(zhì)材料，篩選獲得條帶穩(wěn)定表達(dá)且清晰的30個(gè)引物，其中10個(gè)引物的擴(kuò)增條帶有種質(zhì)特異性。利用這些ISSR引物分析不同種質(zhì)的DNA指紋圖譜，可為紫菜種質(zhì)評價(jià)與分子標(biāo)記鑒定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫菜；絲狀體；ISSR；種質(zhì)鑒定；DNA指紋圖譜

中圖分類號： S917.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0017-03

紫菜屬（Pyropia）為大型海產(chǎn)紅藻類，全世界約134種，在我國分布約22種，其中條斑紫菜（P. yezoensis）與壇紫菜（P. haitanensis）為主要栽培種類，在海藻產(chǎn)業(yè)中占有重要經(jīng)濟(jì)地位。紫菜不同種類、不同品系種質(zhì)的鑒定與分析是優(yōu)良遺傳資源利用的基礎(chǔ)。紫菜屬物種形態(tài)特征簡單，易受環(huán)境影響，依靠傳統(tǒng)形態(tài)性狀難以準(zhǔn)確鑒別，且隨著育種材料遺傳基礎(chǔ)研究的不斷深入及選育品種數(shù)目的日益增多，品種間差異越來越小。采用基于DNA水平的標(biāo)記技術(shù)，有助于準(zhǔn)確、直接獲得不同種質(zhì)間的遺傳差異，將大量種質(zhì)資源區(qū)分開來。由高多態(tài)性分子標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜如SSR、SRAP等標(biāo)記方法[1-5]具有明顯的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于大型海洋藻類的不同種質(zhì)評價(jià)、鑒定或純度分析中。ISSR標(biāo)記的原理與SSR相似[6]，其擴(kuò)增位點(diǎn)具有豐富的等位變異性，是一種操作簡便、成本較低的DNA標(biāo)記方法，在植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、進(jìn)化與遺傳多樣性等方面有大量研究[7]，在紫菜遺傳特性、親緣關(guān)系相關(guān)研究中也有不少報(bào)道[8-10]。本研究利用ISSR技術(shù)，對國家級紫菜種質(zhì)庫保有的一些優(yōu)良種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳特性分析，構(gòu)建這些種質(zhì)的特征性DNA圖譜，為紫菜種質(zhì)的評價(jià)與分子標(biāo)記鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品材料與基因組總DNA提取

絲狀體樣品（表1），由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所國家紫菜種質(zhì)庫提供。取樣品絲狀體組織，用TaKaRa試劑盒（編號：DV811A）提取基因組總DNA，于4 ℃保存，備用。DNA濃度用加標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳檢測（圖1）。

1.2 PCR擴(kuò)增與圖譜分析

ISSR引物為British Columbia大學(xué)公布的第9套引物，由上[CM（25]海生工合成；MgCl2、dNTP及Taq[KG*3]DNA 聚合酶等試劑為上[CM）]

海生工產(chǎn)品；250 bp DNA marker為TaKaRa產(chǎn)品（編號：D515A）。PCR反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行，先選取3個(gè)DNA模板分組進(jìn)行100條引物的PCR擴(kuò)增篩選；對模板、Mg2+、dNTP濃度、引物及退火溫度等多個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化選擇；選用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.5 mmol/L、約20 ng的DNA 模板和1.5 U Taq酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所有引物采用同一PCR反應(yīng)參數(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠中含定量的溴化乙錠（EB）。由紫外分析儀觀察結(jié)果并拍照。在圖譜中，以引物每一個(gè)相同遷移位置的DNA擴(kuò)增帶作為同一個(gè)位點(diǎn)，記為1，無帶則為0，將DNA帶的有無轉(zhuǎn)化成（0、1）數(shù)據(jù)矩陣；利用NTSYS-pc version2.10e軟件[11]計(jì)算樣品間的遺傳相似性系數(shù)（GS），用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與紫菜絲狀體的特異性擴(kuò)增

在設(shè)定的PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)參數(shù)中，有30個(gè)引物在紫菜4個(gè)種類中穩(wěn)定擴(kuò)增出DNA片段，有些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物可直接區(qū)分出不同種（表2）。少精紫菜（A5）相對于其他3個(gè)種類紫菜有明顯差異，較容易被區(qū)分出來，這些引物包括808、810、816、818、826、827、847、861、886、887；少精紫菜在引物為816的電泳圖譜中，在1 250～2 250 bp之間有3個(gè)特異條帶，在引物829的電泳圖譜中，壇紫菜（A1、A2）在1 000 bp處有1個(gè)特異條帶（圖2）；條斑紫菜在500 bp及1 200 bp附近均各有1個(gè)特異條帶（圖3）。

2.2 條斑紫菜不同品系遺傳差異

由圖3可見，條斑紫菜B1-2有1個(gè)亮帶不同于其他品系；品系C1為采自青島、最早保存的純系，比另外3個(gè)較晚些的保持系（C2、C3、C4）多1或2個(gè)條帶；品系C4為最晚選育的保持系，比C1、C2、C3在約1 000 bp處少1個(gè)條帶；F組為具優(yōu)良性狀的條斑紫菜栽培品系，樣品F1比F2、F3多1個(gè)特征帶；J組為綠色株系不同培育組織的絲狀體，樣品J1、J3比樣品J2、J4多1或2個(gè)條帶；D組間的樣本沒有明顯差異。引物829可作為條斑紫菜不同品系特異性條帶的分子標(biāo)記。

由圖3、圖4可見，引物888在條斑紫菜的多個(gè)種質(zhì)也得到特異性表達(dá)條帶，其中：D組品系間的譜帶與引物829的有所不同，C組、J組品系間條帶表達(dá)與829的相一致；D1組樣品來自日本，其擴(kuò)增結(jié)果不同于南通產(chǎn)區(qū)的D2、D3及D4，后三者條帶表達(dá)基本一樣，均在500～1 000 bp之間相同位置有3條亮帶；J1與J3條帶一樣，J2與J4結(jié)果相近，這與用引物829擴(kuò)增的結(jié)果基本一致；F組中的3個(gè)優(yōu)選栽培品系譜帶均各有特異性表達(dá)。

2.3 遺傳相似性與聚類分析[JP2]

由圖5可見，在4種紫菜中，南方的壇紫菜與華北的半葉紫菜遺傳相似性為0.735 4，少精紫菜與條斑紫菜為0.705 8，條斑紫菜與壇紫菜、少精紫菜與半葉紫菜的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，這與崔靈英等的結(jié)論[8]相似；條斑紫菜種內(nèi)各種質(zhì)雖聚于一起，但樣品間的相似度相差較大，來自南通同一海域的優(yōu)選育種材料16號與17號樣品具有最大遺傳相似性，系數(shù)為0960 8，其次是10號與17號、6號與9號，相似系數(shù)分別為0921 6、0901 9。

3 結(jié)論與討論

在同一反應(yīng)條件下，30個(gè)有穩(wěn)定擴(kuò)增條帶的引物中有10[FL）]

個(gè)引物獲得特異性表達(dá)，以829、888等不同引物對同一種質(zhì)、同一引物對不同種質(zhì)擴(kuò)增可以產(chǎn)生不同的特異性條帶，并得到多個(gè)種質(zhì)的擴(kuò)增圖譜。在這些圖譜中，不同種類或品系有獨(dú)一的指紋模式，用引物816、829可區(qū)分出少精紫菜、壇紫菜；針對27個(gè)條斑紫菜，引物829、888可用于條斑紫菜種內(nèi)多個(gè)品系鑒定。樣品F3為顯示條斑紫菜形態(tài)性狀的雜交品系，ISSR擴(kuò)增圖譜也多與條斑紫菜一致，這表明該標(biāo)記既可構(gòu)建特異性圖譜，也可反映種質(zhì)屬性。有研究報(bào)道，部分引物如812、830、834、850、859、866、878、881、895等可以得到擴(kuò)增產(chǎn)物[7]，但由于試驗(yàn)條件或試驗(yàn)參數(shù)等原因，本試驗(yàn)未能獲得相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，因此，充分優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)、規(guī)范試驗(yàn)操作，才有助于構(gòu)建可供比較的指紋圖譜模式。

ISSR標(biāo)記由于引物中帶有錨定堿基，既有高多態(tài)性又有較高穩(wěn)定性，通過單個(gè)或多個(gè)引物組合使用，即能得到可靠的結(jié)論。在一些其他大型海藻種質(zhì)資源研究中，ISSR方法已是常用的研究方法之一[12-14]，筆者所在實(shí)驗(yàn)室也用該方法評價(jià)了三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、西施舌（Coelomactra antiquata）及大黃魚（Pseudosciaena crocea）等[15-17]海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的遺傳資源狀況，并結(jié)合應(yīng)用DNA序列等標(biāo)記技術(shù)，檢測了ISSR方法的可靠性。筆者在探索簡便易行的種質(zhì)鑒定方法時(shí)，利用ISSR已得到多個(gè)條斑紫菜品系的獨(dú)一指紋圖譜[18]，這些DNA指紋標(biāo)記，在資源的交換與引種等過程中可作為其品種身份信息的一個(gè)內(nèi)容。

國家級紫菜種質(zhì)庫收集有大量野生紫菜種質(zhì)資源，并選育獲得多個(gè)優(yōu)良種質(zhì)材料，如何更有效地探究這些資源的遺傳多樣性，有選擇地把優(yōu)良的遺傳變異性狀引入到栽培品種中，DNA指紋圖譜的構(gòu)建無疑將為這些種質(zhì)的鑒定與利用提供幫助。目前，國際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV） 已將DNA指紋圖譜鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容[19-20]。當(dāng)然，在采用ISSR 標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜時(shí)，應(yīng)力求簡化、規(guī)范試驗(yàn)操作程序及遺傳分析方法，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，使構(gòu)建的指紋圖譜更具有可操作性。

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