李永博+劉冰江+霍雨猛+繆軍+楊建平+吳雄+楊妍妍

摘 要：

根據(jù)細(xì)香蔥orfA501開發(fā)的特異引物，以洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為試材進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)獲得的片段進(jìn)行回收測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物進(jìn)行染色體步移，獲得部分側(cè)翼序列，開發(fā)了鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型的SCAR標(biāo)記，命名為OC2175。該標(biāo)記在洋蔥不育系中擴(kuò)增出一條2 175 bp的特異條帶和1 053 bp的條帶，而保持系中僅擴(kuò)增出1 053 bp的條帶。對(duì)17組不同遺傳背景的不育系及其相應(yīng)的保持系進(jìn)行驗(yàn)證，該SCAR標(biāo)記的鑒定結(jié)果與田間表型判斷結(jié)果完全吻合。

關(guān)鍵詞：洋蔥;細(xì)胞質(zhì)雄性不育;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S633.203.6 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2015）06-0001-04

Development of a Molecular Marker Identifying

Cytoplasmic Male Sterility Gene in Onion（Allium cepa L.）

Li Yongbo1，2，Liu Bingjiang2，Huo Yumeng2，Miao Jun2，Yang Jianping1，Wu Xiong2，Yang Yanyan2*

（1. College of Horticulture Science and Engineering of Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;

2. Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

Abstract The specific primers of orfA501 in chives and cytoplasmic male sterile line of onion were used to PCR amplification. The amplified fragment was extracted and sequenced. The primers were designed according to the obtained sequence for genome walking， and partial flanking sequence was obtained. Then a SCAR marker was developed and named as OC2175. With this marker， a special fragment of 2 175 bp could be obtained from the male sterile lines and a 1 053 bp fragment was amplified from both （s）-cytoplasm and （N）-cytoplasm. Seventeen pairs of male sterile lines and their corresponding maintainer lines with different genetic backgrounds were used to verify this SCAR marker. The results indicated that the SCAR marker was perfectly suitable for distinguishing the cytoplasm types S or N in onion.

Key words Onion; Cytoplasmic male sterility; Molecular marker

洋蔥（Allium cepa L.），又稱圓蔥、蔥頭，百合科蔥屬，已有5 000多年的栽培歷史。1936年美國的Jones和Emsweller 首次在“Italian Red”品種中發(fā)現(xiàn)雄性不育株[1]，1943年Jones和Clarke又發(fā)現(xiàn)了雄性不育系[2]。隨后洋蔥成為世界上最早利用雜種優(yōu)勢(shì)的蔬菜作物之一。洋蔥是兩年生植物，其育種年限是白菜、蘿卜等蔬菜的2～4倍，與傳統(tǒng)的測(cè)交-回交、自交等方法相比，分子標(biāo)記技術(shù)直接以DNA形式出現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)，不受季節(jié)、環(huán)境的限制，可大大縮短不育系和保持系的選育年限，減少工作量，加快育種進(jìn)程。

國內(nèi)外關(guān)于洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究報(bào)道較少，Havey[3]利用RFLP分子標(biāo)記手段找出了洋蔥雄性保持系和不育系線粒體基因組之間的差異。Engelke等[4，5]得到了鑒定洋蔥S型、N型和T型細(xì)胞質(zhì)的分子標(biāo)記。Sato[6]利用CMS特殊線粒體核苷酸序列的PCR擴(kuò)增來鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型。李園園等[8]對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系進(jìn)行RAPD分析，成功獲得了一個(gè)RAPD標(biāo)記。Kim等[7]在S型和T型細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)嵌合的開放閱讀框orf725，并且開發(fā)了一個(gè)區(qū)分三種洋蔥細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記。

由于細(xì)胞質(zhì)中的DNA序列易產(chǎn)生缺失、插入等變異現(xiàn)象，再加上遺傳背景、人工選擇和自然選擇的差異等，上述很多研究，存在可操作性差、重復(fù)性低、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本研究旨在結(jié)合TAIL-PCR[9]和SCAR標(biāo)記方法開發(fā)一種鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)育性的分子標(biāo)記，以準(zhǔn)確區(qū)分洋蔥S型和N型細(xì)胞質(zhì)，避免選擇的盲目性，提高選擇效率，加快洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系的選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為本課題組選育的17組洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其相應(yīng)的保持系，于2011年9月10日播種于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)基地，11月初定植，并提取洋蔥基因組總DNA，2013年6月田間檢測(cè)花粉育性。endprint

1.2 DNA的提取及基因池的建立

洋蔥基因組總DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒，提取方法參照說明書。瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。

應(yīng)用分離群體分組分析法（Bulked Segregation Analysis）即BSA法，將不育系的10個(gè)單株和與之對(duì)應(yīng)的保持系10個(gè)單株的DNA樣品分別等量混合，組成洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的基因池。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Engelke等[5]報(bào)道的特異引物5′-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3′和5′-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3′對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系S118及其相應(yīng)的保持系N218的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所得片段按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明進(jìn)行回收純化，純化片段克隆至Promega公司的pGEM-T Easy 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)TAIL-PCR引物進(jìn)行染色體步移，獲得了該片段的側(cè)翼序列。根據(jù)獲得的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物，OC2175-F：5′-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3′;OC2175-R：5′-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3′。由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成，PAGE純化。

1.4 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR擴(kuò)增均在美國伯樂的TC-XP-D型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，回收純化片段的擴(kuò)增參照Engelke和Tatlioglu的方法。所得標(biāo)記OC2175采用如下體系： 10×PCR Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTPs （each 2.5 mmol/L）2.0 μL，Primer1、2（0.5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA polymerase 1 U，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)成像。

1.5 單株驗(yàn)證

將所得標(biāo)記在17組洋蔥雄性不育系及相應(yīng)的保持系組合中進(jìn)行單株驗(yàn)證。從每個(gè)株系中隨機(jī)選取10株提取基因組總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與田間觀察判斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.6 DNA序列分析

將獲得的側(cè)翼序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組總DNA的檢測(cè)分析

提取所得洋蔥基因組總DNA溶液清亮，無褐化現(xiàn)象。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示所提取的DNA在點(diǎn)樣孔處無明顯殘留，表明多糖和蛋白質(zhì)含量均較低; DNA帶位于同一位置，清晰、無彌散、無降解現(xiàn)象（圖1）。在紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定DNA樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，表明提取的洋蔥基因組總DNA純度較高，適用于PCR擴(kuò)增、AFLP分子標(biāo)記等生物學(xué)試驗(yàn)。

M：DNA Marker DL2000;S1～S10：不育系;N1～N10：保持系

圖1 洋蔥基因組總DNA的電泳圖譜

2.2 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育SCAR標(biāo)記的獲得及序列分析

根據(jù)Engelke等[5]報(bào)道的特異引物5′-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3′和5′-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3′對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系S118及其相應(yīng)的保持系N218的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅在S118部分個(gè)體中擴(kuò)增出長度為473 bp的片段，根據(jù)473 bp的核苷酸序列，應(yīng)用TAIL-PCR方法進(jìn)行染色體步移，獲得了全長為2 175 bp的側(cè)翼序列，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型的SCAR標(biāo)記，其擴(kuò)增引物為OC2175-F和OC2175-R。 應(yīng)用該標(biāo)記對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系S118及其相應(yīng)的保持系N218進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在洋蔥不育系中均擴(kuò)增出一條2 175 bp的特異性條帶和一條1 053 bp的條帶，而相應(yīng)的保持系N218只擴(kuò)增出1 053 bp的條帶（圖2），將此標(biāo)記命名為OC2175。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)2 175 bp的序列進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該片段的5′端與洋蔥的COXⅠ基因（GU138027.2）高度同源，同源性達(dá)到99%。

M：DNA Marker DL2000;S：S118的單株;N：N218的單株

圖2 引物OC2175-F、OC2175-R對(duì)洋蔥不育系及其保持系的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 SCAR標(biāo)記在洋蔥不育系及保持系中的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證SCAR標(biāo)記OC2175在分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用上的可行性，利用具有不同遺傳背景的已知細(xì)胞質(zhì)基因型的17個(gè)組合材料進(jìn)行PCR驗(yàn)證（表1），結(jié)果表明，所有的不育系中均擴(kuò)增出一條2 175 bp的特異性條帶和一條1 053 bp的條帶，而相應(yīng)的保持系只擴(kuò)增出1 053 bp的條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果與田間判斷結(jié)果吻合。此結(jié)果表明應(yīng)用該引物完全可以鑒別本課題組洋蔥的細(xì)胞質(zhì)基因型。

3 結(jié)論與討論

洋蔥是最早發(fā)現(xiàn)和利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育的蔬菜作物之一[2]。利用Engelke等[5]報(bào)道的特殊引物擴(kuò)增時(shí)，有的株系中條帶非常弱或無擴(kuò)增，認(rèn)為靶基因可能是以Sublimon的形式存在，因此無法應(yīng)用到實(shí)際育種工作中。劉杰等[10]運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的線粒體DNA進(jìn)行了多態(tài)性研究，最終獲得了兩個(gè)多態(tài)性片段。但由于線粒體DNA的提取過程較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使得該標(biāo)記在大規(guī)模田間材料的鑒定工endprint

表1 洋蔥不育系和保持系單株驗(yàn)證結(jié)果

材料編號(hào)類型細(xì)胞質(zhì)類型鑒定株數(shù)2175 bp1053 bp吻合率（%）

S110早熟黃皮不育10++100

N210早熟黃皮可育10-+100

S118早熟黃皮不育10++100

N218早熟黃皮可育10-+100

S502早熟黃皮不育10++100

N602早熟黃皮可育10-+100

S503中熟黃皮不育10++100

N603中熟黃皮可育10-+100

S505中熟黃皮不育10++100

N605中熟黃皮可育10-+100

S512中熟黃皮不育10++100

N612中熟黃皮可育10-+100

S515中熟黃皮不育10++100

N615中熟黃皮可育10-+100

S520中熟黃皮不育10++100

N620中熟黃皮可育10-+100

S117-5-1中熟紅皮不育10++100

N217-5-1中熟紅皮可育10-+100

S117-5-2中熟紅皮不育10++100

N217-5-2中熟紅皮可育10-+100

S117-11-1中熟紅皮不育10++100

N217-11-1中熟紅皮可育10-+100

S117-10-1中熟紅皮不育10++100

N217-10-1中熟紅皮可育10-+100

S117-10-2中熟紅皮不育10++100

N217-10-2中熟紅皮可育10-+100

S117-10-3中熟紅皮不育10++100

N217-10-3中熟紅皮可育10-+100

SL701長日黃皮不育10++100

NL801長日黃皮可育10-+100

SL702長日黃皮不育10++100

NL802長日黃皮可育10-+100

SL703長日黃皮不育10++100

NL803長日黃皮可育10-+100

注：材料編號(hào)中“S”表示不育系，“N”表示相應(yīng)保持系;“+”表示有擴(kuò)增片段; “-” 表示無擴(kuò)增片段。

作中受到限制，且RAPD標(biāo)記重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，其判斷結(jié)果可信度不高。

本研究以遺傳背景幾乎完全相同的洋蔥不育系與保持系為試材，利用TAIL-PCR進(jìn)行染色體步移，獲得側(cè)翼序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物OC2175-F/OC2175-R，開發(fā)了鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型的SCAR標(biāo)記OC2175。對(duì)17個(gè)不同遺傳背景的不育系和保持系組合進(jìn)行驗(yàn)證，PCR檢測(cè)結(jié)果和田間判斷結(jié)果完全吻合，擴(kuò)增條帶清晰，無模糊條帶。該結(jié)果表明，OC2175是洋蔥不育細(xì)胞質(zhì)的特異性標(biāo)記，可應(yīng)用于洋蔥分子標(biāo)記輔助育種。此外，該SCAR標(biāo)記只需在苗期提取基因組總DNA，通過簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增即可鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型，不僅避免了常規(guī)育種方法的繁瑣過程和盲目性，更有效避免了錯(cuò)誤分類，減少了工作量和育種成本，加快了育種進(jìn)程，為建立具有普遍意義的洋蔥分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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