張琳，劉元元，王彥，閆超,2

（1.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240; 2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

前言

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis, CE）是一種新型液相分離分析技術(shù)，以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，高壓直流電場(chǎng)產(chǎn)生的電滲流為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)試樣中各組分的電泳淌度差異實(shí)現(xiàn)分離[1]。具有分離效率高、分析速度快、溶劑消耗少且分離模式多等諸多優(yōu)點(diǎn)，但理論分析表明, 由于電泳過程中毛細(xì)管兩端加了高壓電場(chǎng)，引起毛細(xì)管中電解質(zhì)產(chǎn)生焦耳熱，將使流體在徑向產(chǎn)生拋物線形溫度分布，毛細(xì)管軸中心溫度比近壁處溫度高。溶液粘度隨溫度升高呈指數(shù)下降，溫度梯度使介質(zhì)粘度在徑向產(chǎn)生梯度，從而影響溶質(zhì)遷移速度，毛細(xì)管中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快，造成譜帶展寬，柱效下降的不利后果[2]。

傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)利用一臺(tái)柱上紫外檢測(cè)器和一臺(tái)高壓電源即可搭建，但因?yàn)闆]有毛細(xì)管溫度控制存在分析精度差和重復(fù)性（RSD）不理想的缺點(diǎn)，目前市場(chǎng)上還沒有用于毛細(xì)管溫度控制的產(chǎn)品的信息，這給研究工作帶來一定的困難。市場(chǎng)成熟的進(jìn)口毛細(xì)管電泳產(chǎn)品將毛細(xì)管溫度控制系統(tǒng)集成到產(chǎn)品內(nèi)部，而且產(chǎn)品價(jià)格昂貴，對(duì)于科研經(jīng)費(fèi)比較少的實(shí)驗(yàn)室來講也是一大難題。本研究利用低功耗，高性能CMOS8位單片機(jī)AT89S52作為微處理器，以帕爾帖元件的半導(dǎo)體制冷原理和PID算法為控制基礎(chǔ)，配以合理的毛細(xì)管溫控循環(huán)管路，設(shè)計(jì)一個(gè)毛細(xì)管電泳毛細(xì)管溫度控制模塊。在電泳過程中，對(duì)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中的毛細(xì)管進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)控制。通常使毛細(xì)管在低溫下工作以消除電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱，降低焦耳熱造成的不利影響，提高毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的分離效率、精確度和重復(fù)性。

1 系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)與工作原理

系統(tǒng)總體框圖如圖1所示。系統(tǒng)可分為單片機(jī)（MCU）、鍵盤輸入、溫度顯示、溫度采集、溫度控制和狀態(tài)讀取與處理等部分。系統(tǒng)工作原理為：微控制器計(jì)算溫度采集電路采集恒溫箱的溫度值與鍵盤設(shè)定的溫度值的偏差，利用數(shù)字PID算法實(shí)時(shí)調(diào)整PWM的值，即可調(diào)整半導(dǎo)體驅(qū)動(dòng)電路的兩端的電壓值，最終實(shí)現(xiàn)恒溫控制。通過H橋電路的切換，實(shí)現(xiàn)加熱與制冷的轉(zhuǎn)換。柱溫箱狀態(tài)監(jiān)控電路監(jiān)控柱溫箱的狀態(tài)包括柱溫箱內(nèi)的液位檢測(cè)和循環(huán)管路的流速監(jiān)控，如果柱溫箱狀態(tài)出現(xiàn)故障，系統(tǒng)通過顯示告知用戶故障信息。

2 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)

2.1 半導(dǎo)體制冷片的選擇與驅(qū)動(dòng)電路

半導(dǎo)體制冷[3,4]也稱熱電制冷，是一門介于制冷技術(shù)和半導(dǎo)體技術(shù)邊緣的學(xué)科，半導(dǎo)體制冷是以溫差電現(xiàn)象為基礎(chǔ)制冷方法，利用帕爾帖效應(yīng)的原理達(dá)到制冷目的。本系統(tǒng)選擇型號(hào)為TEC1-12706D的半導(dǎo)體制冷片，根據(jù)提供參數(shù)得知該半導(dǎo)體制冷片是陶瓷式的，電偶對(duì)總數(shù)為127對(duì)，允許通過的最大電流Imax(A)=6.0A，最大電壓Vmax= 15.4 V，在室溫下，最大制冷溫差△Tmax=68℃，最大制冷量Qcmax= 70.3W，外形尺寸為40 mm×40 mm×3.8mm。水箱底部尺寸為90 mm×90 mm×40 mm，因此選擇4組半導(dǎo)體制冷片平鋪在水箱下方。

制冷片的驅(qū)動(dòng)電路是采用H橋驅(qū)動(dòng)電路[5,6]來驅(qū)動(dòng)的，H橋主要由兩個(gè)P通道MOS管和兩個(gè)N通道MOS管組成，該驅(qū)動(dòng)方式通過半導(dǎo)體兩端的電壓方向來實(shí)現(xiàn)加熱和制冷。如圖2所示：PWM1和CTRL為高電平,PWM2和CTRL2為低電平時(shí)；半導(dǎo)體制冷片對(duì)柱溫箱加熱，微控制器將溫度采集電路采集的溫度值與設(shè)定值進(jìn)行比較，經(jīng)過PID控制算法的計(jì)算，微控制器由PWM1口輸出相應(yīng)的PWM信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)柱溫箱的加熱恒溫控制。反之，PWM1和CTRL為低電平，PWM2和CTRL2為高電平時(shí)，此時(shí)半導(dǎo)體制冷片電壓翻轉(zhuǎn)，半導(dǎo)體制冷片對(duì)柱溫箱進(jìn)行制冷，微控制器將溫度采集電路采集的溫度值與設(shè)定值進(jìn)行比較，經(jīng)過PID控制算法的計(jì)算，微控制器由PWM2口輸出相應(yīng)的脈寬調(diào)制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)柱溫箱的制冷恒溫控制。

2.2 溫度傳感器的選擇

溫度測(cè)量部分使用的是美國(guó)DALSS公司生產(chǎn)的數(shù)字溫度傳感器，它的體積小，使用方便，單線的接口方式，一條數(shù)據(jù)線即可實(shí)現(xiàn)DS18B20與微處理器的雙向通訊。溫度測(cè)量范圍-55℃～+125℃，固有測(cè)量精度為±0.5℃（-10℃～85℃），最小分辨率為0.0625℃，不銹鋼外殼封裝的尺寸為?6*30mm,同時(shí)數(shù)據(jù)線為制作成防腐蝕、耐高溫的導(dǎo)線，能夠保證直接浸泡在液體介質(zhì)中使用。

2.3 鍵盤及顯示電路

鍵盤用作控制信息的輸入。系統(tǒng)采用4個(gè)按鍵，分別實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的復(fù)位、設(shè)定溫度逐次加1 、設(shè)定溫度逐次減1 和確定所設(shè)定溫度。系統(tǒng)的初始溫度為25℃，用戶可根據(jù)實(shí)際需要自行設(shè)定。系統(tǒng)采用液晶顯示器1602顯示設(shè)定的溫度和當(dāng)前的溫度，不僅節(jié)省了單片機(jī)的I/O口資源，還使顯示更加穩(wěn)定。

3 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

3.1 流程圖

系統(tǒng)軟件總體流程圖如圖3所示，系統(tǒng)上電后，進(jìn)行系統(tǒng)初始化，包括I/O的輸入輸出設(shè)定，初始溫度采集及顯示等，當(dāng)鍵盤輸入設(shè)定值后，系統(tǒng)會(huì)將實(shí)時(shí)溫度與設(shè)定溫度進(jìn)行比較，經(jīng)過PID控制算法計(jì)算，微控制器根據(jù)結(jié)果輸出相應(yīng)的PWM信號(hào)，驅(qū)動(dòng)H橋電路實(shí)現(xiàn)恒溫控制。

3.2 PID控制算法

根據(jù)溫度緩慢變化的特點(diǎn)，系統(tǒng)采用積分分離PID控制算法[7]進(jìn)行控制，大大減少了超調(diào)量，降低了往復(fù)次數(shù)，提高了控制精度。該算法的思想是：根據(jù)被控對(duì)象的實(shí)際情況，設(shè)定一個(gè)偏差限值e，如果被控制量與設(shè)定值的偏差絕對(duì)值大于e，為避免積分作用使系統(tǒng)的穩(wěn)定性變差，超調(diào)量加大，系統(tǒng)不會(huì)引入積分作用，此時(shí)只執(zhí)行PD控制；當(dāng)偏差的絕對(duì)值小于或等于e時(shí)，才會(huì)引入積分控制作用，即此時(shí)控制系統(tǒng)采用增量式PID控制，利用積分作用最終消除靜差，提高控制的精度。積分分離PID控制算法可表示為：

式中，e(k)為本次采樣偏差，e(k-1) 為上次采樣偏差，β是一個(gè)雙值權(quán)系數(shù)，當(dāng)|e(k)|＜e時(shí)，的值為1，當(dāng)|e(k)|＞e時(shí)，β的值為0。

如上所述，PID主要控制參數(shù)KP、KI、KD的選取是恒溫系統(tǒng)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，本研究采取方法是試湊法：首先選擇比例系數(shù)KP，以保證系統(tǒng)對(duì)偏差值有高靈敏度，可以快速響應(yīng)輸出，KP值不能過大，否則會(huì)導(dǎo)致控溫系統(tǒng)不穩(wěn)定；之后選擇積分系數(shù)KI，當(dāng)系統(tǒng)控制結(jié)果出現(xiàn)較大的震蕩超調(diào)時(shí)，增大KI以減少系統(tǒng)調(diào)節(jié)的靜誤差量，使控制溫度逐漸趨于設(shè)置溫度值；最后選擇微分系數(shù)KD，KD的作用是根據(jù)偏差信號(hào)變化的速率提前控制輸出一個(gè)調(diào)節(jié)動(dòng)作，縮短控制過渡時(shí)間[8]，使系統(tǒng)盡快進(jìn)入平衡調(diào)節(jié)范圍內(nèi)。系統(tǒng)設(shè)定的偏差限值e=2。

4 溫度控制模塊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

溫度控制模塊的結(jié)構(gòu)包括三部分，分別是恒溫箱、蠕動(dòng)泵、硅膠管和毛細(xì)管管套。工作原理為：系統(tǒng)對(duì)恒溫箱內(nèi)的液體進(jìn)行溫度控制，蠕動(dòng)泵、硅膠管和毛細(xì)管管套構(gòu)成液體循環(huán)回路，讓恒溫箱內(nèi)部的液體在循環(huán)回路中不斷地流動(dòng)，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。毛細(xì)管管套將毛細(xì)管引入液體循環(huán)回路中，利用液體換熱的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管的溫度控制。溫度控制模塊結(jié)構(gòu)如圖4所示。

4.1 恒溫箱的結(jié)構(gòu)

恒溫箱結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖5所示，半導(dǎo)體制冷片安裝在水箱與鋁制散熱器之間，水箱和制冷片之間、制冷片與散熱器之間需涂抹薄薄的一層導(dǎo)熱硅脂，用于提高熱交換效率。水箱的外表面需要粘貼厚度為4 mm的保溫棉，防止在系統(tǒng)工作時(shí)水箱與外界空氣進(jìn)行熱交換。本系統(tǒng)主要是起到制冷功能，為使制冷效果良好，制冷片下方安裝鋁制散熱器及散熱風(fēng)扇，在系統(tǒng)處于制冷狀態(tài)或者溫度下降狀態(tài)時(shí)風(fēng)扇開啟，形成強(qiáng)制對(duì)流散熱系統(tǒng)。水箱和散熱器都選用熱傳導(dǎo)率僅次于金、銀和銅的材料鋁，其熱傳導(dǎo)率為237 W/Mk，由于水箱內(nèi)部長(zhǎng)期有水冷液存在，需對(duì)其進(jìn)行噴塑表面處理，增加水箱的耐腐蝕性。

4.2 溫度控制循環(huán)管路的結(jié)構(gòu)

毛細(xì)管溫度控制模塊的液體循環(huán)管路由硅膠管和毛細(xì)管管套組成，毛細(xì)管管套結(jié)構(gòu)如圖6所示。兩個(gè)管套頭之間用粗細(xì)兩根硅膠管連接，細(xì)硅膠管的內(nèi)徑為2mm，外徑為4mm；粗硅膠管的內(nèi)徑為8mm，外徑為10mm。在系統(tǒng)在制冷時(shí)，由于結(jié)露現(xiàn)象[9]，細(xì)硅膠管的表面會(huì)產(chǎn)生冷凝水，毛細(xì)管管套內(nèi)外兩根硅膠管能夠很好的抑制細(xì)硅膠管表面冷凝水的產(chǎn)生，同時(shí)粗硅膠管還起到保溫的作用。在兩個(gè)堵頭將毛細(xì)

管固定在細(xì)硅膠管內(nèi)，且在系統(tǒng)工作時(shí)，防止水冷液流出。毛細(xì)管管套將毛細(xì)管引入液體循環(huán)管路中，通過恒溫箱內(nèi)部的液體循環(huán)與毛細(xì)管表面的溫度進(jìn)行熱交換，實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管溫度控制的效果。毛細(xì)管管套的硅膠管、管套座和堵頭拆卸方便，不存在盲穿毛細(xì)管的過程，所以更換毛細(xì)管非常方便。毛細(xì)管管套能夠適應(yīng)各種長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)毛細(xì)管，只需要改變兩個(gè)管套頭之間的硅膠管的長(zhǎng)度即可實(shí)現(xiàn)，這樣毛細(xì)管溫度控制模塊可以適用于各種毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。

5 系統(tǒng)性能與驗(yàn)證

應(yīng)用上述方法，本研究設(shè)計(jì)的毛細(xì)管溫度控制模塊能夠?qū)銣叵鋬?nèi)的液體實(shí)現(xiàn)4℃～40℃的溫度精確控制，控制精度為±0.5℃，如果能夠提高測(cè)溫元件的精確度，則能夠?qū)崿F(xiàn)更好的控溫效果。設(shè)計(jì)的溫度控制循環(huán)管路能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同長(zhǎng)度毛細(xì)管的溫度控制，大大增加了設(shè)計(jì)的毛細(xì)管溫度控制模塊對(duì)不同毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的適應(yīng)性。

將設(shè)計(jì)的毛細(xì)管溫度控制模塊與上海通微分析技術(shù)有限公司的qSepTM-3010型全自動(dòng)定量毛細(xì)管電泳系統(tǒng)[10,11]聯(lián)用，用全自動(dòng)定量毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分離六種核苷（胞嘧啶、5-氟-2'-脫氧尿苷、腺苷、尿嘧啶、尿苷、肌苷）。驗(yàn)證設(shè)計(jì)的毛細(xì)管溫度控制模塊對(duì)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)起到的改善作用。

選擇背景電解質(zhì)為30 mM，pH為9.4的硼酸緩沖液；設(shè)置加電電壓15 kV，泵速1.0 μL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣體積10nL,分離毛細(xì)管40 有效長(zhǎng)度，50 μm i.d.，360 μm o.d.，毛細(xì)管柱溫箱溫溫度設(shè)定12℃，在此實(shí)驗(yàn)條件下，6種樣品的分離譜圖如圖7。

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，在毛細(xì)管溫度控制在12℃和毛細(xì)管不控溫兩種情況下，連續(xù)進(jìn)樣，考查六種核苷的時(shí)間和峰面積重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管的低溫控制后，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的性能得到提高，六種組分的遷移時(shí)間重復(fù)性均在0.6%以下，同時(shí)六種組分的峰面積重復(fù)性在恒定低溫控制后也得到了明顯的改善，均在3%以下，其中峰面積RSD值最小的是胞嘧啶的0.5%。

6 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)的毛細(xì)管溫度控制模塊，具有精度高、響應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)恒溫箱內(nèi)液體實(shí)現(xiàn)4℃～40℃的精確控溫，控溫精度±0.5℃。將溫度控制模塊與CE系統(tǒng)聯(lián)用后，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，毛細(xì)管溫度控制后，6種核苷樣品分離的時(shí)間重復(fù)性從原來的1%～2%，都提升到0.5%左右，峰面積重復(fù)性也提升了1個(gè)百分點(diǎn)，均在3%以下。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了，本研究設(shè)計(jì)的溫度控制模塊能夠有效的對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行低溫控制，降低焦耳熱的影響，提高了該電泳系統(tǒng)的重復(fù)性。

另外，本研究設(shè)計(jì)的液體溫度控制循環(huán)管路能夠滿足不同長(zhǎng)度毛細(xì)管，增強(qiáng)溫度控制模塊對(duì)多種CE系統(tǒng)的適應(yīng)性?？梢宰寣?shí)驗(yàn)室人員無需購(gòu)買價(jià)格昂貴的進(jìn)口CE產(chǎn)品，自己就可搭建帶有毛細(xì)管溫度控制系統(tǒng)的模塊化CE系統(tǒng)。

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