郝景鋒，張秀峰，劉立明，張宇航，崔永鎮(zhèn)，李心慰，劉國文

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林132101 ；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150030；3.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062）

鹿結(jié)核病（Deer tuberculosis）是一種慢性、消耗性人獸共患傳染病，對(duì)養(yǎng)鹿業(yè)危害巨大，梅花鹿等多個(gè)鹿種均可感染本病，嚴(yán)重制約著養(yǎng)鹿業(yè)的健康發(fā)展?，F(xiàn)有研究表明，牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）是鹿結(jié)核病的主要病原體，隨著養(yǎng)鹿業(yè)的快速發(fā)展，作為對(duì)鹿養(yǎng)殖業(yè)危害巨大的鹿結(jié)核病越來越受到社會(huì)的重視和關(guān)注。但鹿結(jié)核病的診斷一直沒有規(guī)定性標(biāo)準(zhǔn)，鹿結(jié)核病診斷方法主要參照牛結(jié)核病的診斷，現(xiàn)將各種診斷方法匯報(bào)如下。

1 臨床診斷

鹿結(jié)核病是一種慢性、消耗性疾病，臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦，食欲下降，精神沉郁，被毛雜亂失去光澤，皮膚彈性下降，結(jié)核菌主要侵害呼吸系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為呼吸困難，張口呼吸，氣喘，先干咳后濕咳，胸部聽診時(shí)出現(xiàn)干性、濕性啰音或胸膜摩擦音，母鹿可出現(xiàn)空懷或產(chǎn)弱胎，公鹿生茸量降低，甚至不產(chǎn)茸。本病病程通常較長，可長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，死于衰竭。臨床癥狀診斷雖然快捷，但不是很精確，只能作為診斷參考。

2 病理解剖學(xué)診斷

在經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查以及必要的臨床診斷基礎(chǔ)上，病理解剖是診斷鹿結(jié)核病一種常用并且較為可靠的方法，鹿結(jié)核病主要病變?cè)谟诜尾恳约傲馨徒Y(jié)，在肺縱隔、腸系膜、乳房等部位出現(xiàn)粟粒至豌豆大小不等的結(jié)核結(jié)節(jié)，甚至互相融合，變成大的干酪樣壞死，初期較為堅(jiān)硬，后期柔軟，觸之如生面團(tuán)樣感，切開腫大的淋巴結(jié)，流出大量黃白色且無異味的膿汁，漿膜結(jié)核由于大小相似，呈透明或者半透明狀，形如珍珠，俗稱“珍珠腫”。

3 病原學(xué)診斷

對(duì)于鹿結(jié)核病的病原學(xué)診斷包括染色鏡檢和病原培養(yǎng)后分離鑒定。

根據(jù)鹿發(fā)生結(jié)核的不同部位采集病料，主要采集腦脊液、痰液、膿汁、胸水、腹水、糞便以及尿液等病料，直接或經(jīng)過集菌后涂片檢查，集菌的方法有離心沉淀或稀釋飄浮法等，經(jīng)抗酸染色后在顯微鏡下觀察，菌體細(xì)長略彎曲，球桿狀，呈紅色，直徑0.4 μm，長1～4 μm，無鞭毛，不形成芽孢，傳統(tǒng)認(rèn)為無莢膜，最新研究證實(shí)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁外有一層莢膜。由于在制片過程中受到破壞，故觀察不到。若先用明膠處理樣本，可防止莢膜由于脫水而收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū)，即莢膜，具有一定的保護(hù)作用。

4 結(jié)核菌素試驗(yàn)診斷

結(jié)核菌素試驗(yàn)是鹿結(jié)核病診斷的一種非常重要方法，也是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦、在世界各地普遍使用的結(jié)核病常規(guī)診斷方法，它是基于Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)原理的一種皮膚試驗(yàn)。結(jié)核菌素試驗(yàn)可為接種卡介苗及測定免疫效果提供依據(jù)。

5 血清學(xué)診斷

鹿結(jié)核病血清學(xué)診斷被公認(rèn)為一種比較確實(shí)的診斷技術(shù)，目前應(yīng)用較多的血清學(xué)診斷包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、干擾素診斷法、斑點(diǎn)免疫金滲濾法以及免疫印跡法。

5.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） Engvall 和Perlman 1971 年首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，由于ELISA 具有快速、簡潔、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，迅速得到發(fā)展并廣泛應(yīng)用。1976 年ELISA 診斷正式應(yīng)用于結(jié)核病患者抗體檢測[1]，一直作為結(jié)核菌素試驗(yàn)診斷的必要補(bǔ)充，ELISA 方法眾多，診斷技術(shù)不斷完善，間接ELISA 法目前在結(jié)核病診斷中應(yīng)用廣泛，王啟軍等對(duì)鹿結(jié)核病間接ELISA 診斷試劑盒開展了廣泛的實(shí)驗(yàn)研究，成功制備了兔抗鹿酶標(biāo)抗體[2]。對(duì)結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD）、KNO3以及KCl 等浸出抗原進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，從而為成功研制出鹿結(jié)核病間接ELISA 診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

5.2 r 干擾素診斷法 γ干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù)IGRA（interferon-γ release assay ，IGRA）是一種用于結(jié)核桿菌感染的體外免疫檢測的新方法。

PPD 與非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）和卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）有成分交叉[3]，易導(dǎo)致“假陽性”，因此，在普遍接種卡介苗地區(qū)（如我國），對(duì)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）陽性結(jié)果的判定需謹(jǐn)慎。近年來，一種診斷結(jié)核病的免疫學(xué)新方法-γ 干擾素釋放分析（IGRA）逐漸被推廣并應(yīng)用于臨床。IGRA 利用結(jié)核分枝桿菌而非牛分枝桿菌BCG 株系表達(dá)的抗原刺激外周血單核產(chǎn)生IFN-γ。檢測血樣于12～18 h 后判定試驗(yàn)結(jié)果，在2011 年以前，全球只有英國和澳大利亞兩種γ干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）試劑盒被批準(zhǔn)使用[4]，2011 年7 月，我國研發(fā)生產(chǎn)的IGRA 試劑盒(A.TB)正式獲國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。因?yàn)榫哂懈呙舾行院透咛禺愋裕⑶也皇芸ń槊绾痛蠖鄶?shù)非致病分枝桿菌的影響，IGRA 在結(jié)核診斷中對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、操作人員以及實(shí)驗(yàn)條件要求較高，因此在廣大基層無法大范圍推廣使用。

5.3 斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法 1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入免疫化學(xué)，此后斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。斑點(diǎn)免疫金滲濾測定法作為免疫膠體金技術(shù)中重要組成部分在結(jié)核病診斷中發(fā)揮著重大的作用。吳波等研究表明，用DIGFA 檢測結(jié)核分枝桿菌抗體對(duì)肺結(jié)核的診斷，具有敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，操作簡便、快捷，與涂片法、培養(yǎng)法和PCR 相比，對(duì)肺結(jié)核診斷有明顯的優(yōu)勢，具有較高的應(yīng)用價(jià)值[5]。但DIGFA 在實(shí)際研究及應(yīng)用過程中仍存在一些不足之處：首先，在檢測過程中常出現(xiàn)假陰性和假陽性問題。其次，檢測的重復(fù)性及靈敏程度仍然有待于提高，檢測的范圍需要進(jìn)一步拓展。

5.4 免疫印跡法 免疫印跡法（Western blotting）是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于新抗原的鑒定以及抗體的聯(lián)合檢測，該法目前技術(shù)比較規(guī)范，分辨率高、特異性強(qiáng)、可適合大樣本檢測，具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

6 結(jié)核病感染鹿的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>

建立感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒山鉀Q自然感染結(jié)核病傳播以及流行速度慢、養(yǎng)殖試驗(yàn)動(dòng)物花費(fèi)巨大甚至可能造成人畜共患發(fā)生等一系列研究自然發(fā)病規(guī)律的不便，現(xiàn)實(shí)意義重大，建立感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)于結(jié)核病病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制、深入診斷研究是十分必要的，此項(xiàng)技術(shù)在國外已有應(yīng)用，但在國內(nèi)目前此項(xiàng)技術(shù)沒有報(bào)道，McNair J 于2001 年將102-104CFU 菌株通過鹿扁桃體感染，研究表明其病理變化與自然感染病例十分相似[6]，Griffin 于1995-1999 年通過鹿扁桃體攻毒試驗(yàn)，研究表明，10-1CFU 劑量牛型結(jié)核菌通過扁桃體感染，52%以上鹿癥狀明顯，102CFU 劑量牛型結(jié)核菌對(duì)100 多只鹿進(jìn)行多次感染，研究發(fā)現(xiàn)90%以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)癥狀，由于該法對(duì)鹿損傷過大，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失太大，因此目前應(yīng)用較多的是小組實(shí)驗(yàn)法（N=10-15）[7]，有報(bào)道顯示，目前美國學(xué)者通過建立感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒ㄑ芯堪孜猜菇Y(jié)核病。

7 分子生物學(xué)診斷

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌，克服了傳統(tǒng)檢測方法的諸多不足，能夠?qū)﹄y以培養(yǎng)、生長緩慢的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行更加快速、特異、敏感、準(zhǔn)確的鑒定與分析，對(duì)于結(jié)核病的防控起到了其他方法無法替代的作用。結(jié)核病常規(guī)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、DNA 指紋技術(shù)、生物芯片技術(shù)以及核酸探針技術(shù)等。

7.1 PCR 檢測法 在應(yīng)用分子生物技術(shù)檢測鹿結(jié)核病中目前最常見和適合使用的方法就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），1985 年美國Muliis 等發(fā)明PCR，Young 等建立了結(jié)核桿菌基因文庫，成功地分離、鑒定結(jié)核桿菌抗原蛋白編碼基因。1989 年P(guān)CR 技術(shù)首次應(yīng)用于結(jié)核病診斷，該項(xiàng)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，很快得到極大的肯定和廣泛應(yīng)用，Ritelli 等將從巨噬細(xì)胞系中分離培養(yǎng)的分枝桿菌進(jìn)行收集培養(yǎng)后，采用半巢氏PCR 檢測牛結(jié)核分枝桿菌中的特異性插入片段IS6110，判定是否含有牛型結(jié)核分枝桿菌[8]。Aderem A 等1999年利用2個(gè)長度為20個(gè)堿基的寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增編碼牛結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白MPB70 的目標(biāo)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物為372 bp 長度DNA 片段，此產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到，且特異性強(qiáng)[9]。劉桂香等用結(jié)核分枝桿菌引物對(duì)12 份鹿的組織樣本進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果11份出現(xiàn)陽性反應(yīng)，陽性率為91.6%，細(xì)菌培養(yǎng)物1 份為陽性[10]。劉思國等根據(jù)已發(fā)表的牛型結(jié)核分枝桿菌的pncA 基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物并擴(kuò)增出了大小為294 bp 的目的片段，成功地構(gòu)建了牛結(jié)核分枝桿菌特異性檢測的PCR 方法[11]，取得了令人滿意的效果。

7.2 DNA 指紋技術(shù) DNA 指紋是指完全具有個(gè)體特異的DNA 多態(tài)性，其個(gè)體識(shí)別能力足以與手指指紋相媲美，可用來進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親權(quán)鑒定，同人體核DNA 的酶切片段雜交，獲得了由多個(gè)位點(diǎn)上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋是獨(dú)一無二的，故稱為“DNA 指紋”。此技術(shù)通常用于菌種鑒定，從而可以調(diào)查結(jié)核病的暴發(fā)流行，檢測結(jié)核病病原菌來自體內(nèi)還是體外再感染、病原菌敏感性檢查等流行病學(xué)方面的研究，當(dāng)前主要應(yīng)用的有DRE-PCR、Spoligotyping、IS6110-PCR 以及PCR-RELP 等[12]。

7.3 生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、細(xì)胞、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、準(zhǔn)確、大信息量的檢測，是目前分子生物學(xué)最前沿的技術(shù)[13]，按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。

7.4 核酸探針法 核酸探針（Nuclear Acid Probe）是指用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記已知的DNA或RNA 片段。核酸探針技術(shù)最大優(yōu)勢是特異性強(qiáng)，已在不同種群結(jié)核桿菌鑒定和結(jié)核病診斷上的許多方面顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。在結(jié)核病診斷中應(yīng)用的核酸探針技術(shù)主要有寡核苷酸探針、全染色體DNA 探針、RNA 或cDNA 探針及PCR 擴(kuò)增片段探針[14]。

綜上所述，本文從病理學(xué)、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物等方面系統(tǒng)地論述了鹿結(jié)核病診斷技術(shù)的最新研究進(jìn)展，不同時(shí)期不同的診斷技術(shù)都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，對(duì)于不同的診斷技術(shù)應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件、診斷目的和具體情況綜合考慮并全面分析，隨著分子生物的不斷進(jìn)步，相信不久的將來鹿結(jié)核病的診斷技術(shù)會(huì)越來越規(guī)范統(tǒng)一，為鹿養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展發(fā)揮重要作用。

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