舒湘岑 ，陳 靜(孝感市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 孝感 432000)

藥物治療引起的多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)是影響療效的主要因素之一，而P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)過度表達是引起MDR 的常見原因，因此，抑制P-gp 介導(dǎo)的外排作用已成為國內(nèi)外研究熱點。早期的一些外排泵抑制劑如普羅帕酮、維拉帕米等會產(chǎn)生一些不可接受的不良反應(yīng)，從而限制了臨床應(yīng)用。因此，尋找一些無毒、刺激性小、生物相容性好的逆轉(zhuǎn)劑成為新的焦點。D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(D-tocopherol polyethylene glycol succinate，TPGS)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準為可上市的多功能藥物輔料，重要的是，其不僅能促進胞吞，許多研究還證實，其可以有效抑制P-gp 外排作用，從而達到逆轉(zhuǎn)MDR，并且更加高效、安全?，F(xiàn)結(jié)合文獻將其在抑制P-gp 外排方面的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 腫瘤MDR 的形成原因

腫瘤MDR 是MDR 中的一種，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一。其是指當一種藥物作用于腫瘤細胞使之產(chǎn)生耐藥性后，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥的現(xiàn)象。腫瘤細胞的MDR 是由于細胞膜過度表達外排抗腫瘤藥物的蛋白所致，如P-gp 的過度表達。當癌細胞與藥物接觸時藥物與P-gp 結(jié)合，ATP 水解釋放能量，P-gp 借助能量將底物逆濃度梯度泵到細胞外，最終使細胞內(nèi)藥物濃度不斷下降，腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥效應(yīng)［1］。因此，尋找能與P-gp 特異性結(jié)合的藥物是逆轉(zhuǎn)MDR 的重要方法。

2 P-gp 功能與逆轉(zhuǎn)MDR 機制

P-gp 是一種相對分子質(zhì)量為170 ×103的ATP 能量依賴型外排蛋白，又稱為轉(zhuǎn)運ATP 酶(traffic ATPase)［2］。1976 年Juliano 和Ling 首次在MDR 癌細胞系發(fā)現(xiàn)高表達的P-gp。隨后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)P-gp 廣泛表達于小腸上皮細胞，腎、血-腦脊液屏障等多種組織和器官中。P-gp 限制藥物通過血腦屏障，并且阻止?jié)撛诙拘晕镔|(zhì)由小腸入血，因此，其在保護正常組織及維持正常生理功能方面具有重要作用［3-4］。逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR 機制有多種，如抑制P-gp 功能，ATP 水解與結(jié)合是P-gp 發(fā)揮作用的關(guān)鍵，可以干擾ATP 水解過程，阻滯P-gp 介導(dǎo)的藥物逆流;也可以非競爭或競爭性阻滯P-gp 結(jié)合位點而抑制其功能;也可以通過改變細胞膜脂質(zhì)完整性而發(fā)揮作用;還可以同時抑制P-gp的功能和表達。

3 TPGS 濃度對P-gp 抑制作用的影響

TPGS 是維生素E 的水溶性衍生物，具有刺激性小、毒性低、生物相容性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于藥劑學(xué)領(lǐng)域，可作為乳化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑或脂溶性藥物傳遞系統(tǒng)的載體［5］，更重要的是，其具有抑制P-gp 外排功能，在抗腫瘤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

Dintaman 等［6］于1999 年最先研究了TPGS 與P-gp 的關(guān)系。以人結(jié)腸癌細胞系(human colon carcinoma cell line，Caco-2)作為模型，其有類似于小腸上皮的頂側(cè)膜(A)和基底側(cè)膜(B)，且能過度表達P-gp 等外排蛋白，以羅丹明123 為模型藥物，其是一種由P-gp 介導(dǎo)外排的藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.001 0% ～0.002 5%的TPGS 能減少羅丹明123 從Caco-2 細胞膜B-A 的外排，且隨著TPGS 濃度的增加，外排抑制作用增強，若用人回盲腸腺癌細胞(HCT-8)代替Caco-2 細胞，也獲得相似結(jié)果，從而證實TPGS 是一個有效的P-gp 抑制劑。

Collnot 等［7］同樣以Caco-2 細胞系為模型進行研究發(fā)現(xiàn)，維生素E 琥珀酸酯、維生素E 及不同鏈長度的聚乙二醇均沒有對P-gp 的抑制作用，但維生素E 琥珀酸酯與聚乙二醇形成的TPGS 能顯著抑制羅丹明123 在Caco-2 細胞中的外排。同時研究表明，在低于TPGS 的臨界膠束濃度(0.02 wt%)時，其可以抑制P-gp 的功能，從而抑制經(jīng)P-gp 介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運和MDR，高于臨界膠束濃度的條件下，抑制羅丹明123 在Caco-2細胞中的外排作用并不明顯。這可能是因為TPGS 在臨界膠束濃度以下以單聚體形式存在，單體能滲透進入細胞膜，一旦濃度高于臨界膠束濃度則在溶液中形成膠束，一方面無法滲透進細胞膜抑制P-gp 的功能;另一方面將藥物包裹起來，使游離藥物量減少，進而阻礙了吸收［8-9］。

4 TPGS 理化性質(zhì)對P-gp 抑制作用的影響

除TPGS 外，其他非離子表面活性劑，如吐溫-80(Tween 80)、普朗尼克(Pluronic)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)等同樣能抑制P-gp 的功能。有研究證實，TPGS 抑制效果最為明顯，由大至小依次為TPGS、Pluronic PE8100、Cremophor EL、Pluronic PE6100［9］。在各種非離子表面活性劑中，TPGS 表現(xiàn)出較強的P-gp 抑制作用，可能與其理化性質(zhì)有關(guān)。TPGS 既含有維生素E的親脂基團，又含有聚乙二醇長鏈的親水基團，是兩親性的非離子表面活性劑并且有良好的水溶性，室溫時臨界膠束濃度的質(zhì)量分數(shù)約為0.02%(132 μM)，親水親油平衡值(hydrophilelipophile balance，HLB)約為13 ～17，其具有生育酚酯的結(jié)構(gòu)，從而具有一定的抗氧化性?？赡苓@些理化性質(zhì)使其抑制P-gp 的外排作用更強，增加了藥物的吸收，提高了生物利用度［10-11］。

5 TPGS 結(jié)構(gòu)對P-gp 抑制作用的影響

Collnot 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，TPGS 中聚乙二醇(polythylene glycol，PEG)鏈的長短與P-gp 抑制作用有關(guān)。通過實驗證實，TPGS1000 是最有效的P-gp 外排抑制劑，其能有效抑制Caco-2細胞膜上的P-gp，減少羅丹明123 在B-A 方向的轉(zhuǎn)運，但對AB 方向的轉(zhuǎn)運無影響，能使底物羅丹明123 的吸收提高82%，外排降低77%，其抑制效率遠大于不同PEG 鏈長的TPGS 同系物。這些同系物的實驗結(jié)果是通過韋布爾分布(Weibull distribution)擬合發(fā)現(xiàn)的，PEG 鏈長在24 ～33 個鏈節(jié)、相對分子質(zhì)量為1.1 ～1.5 ×103的TPGS 抑制活性最強。推測可能是PEG 鏈的長度影響了TPGS 的理化性質(zhì)。

Wempe 等［12］對TPGS 同系物的親水部分和親脂部分分別進行了修飾，方法及結(jié)果如下:(1)親水部分，如果將PEG 換成等鏈長的PEG-聚丙二醇(poly propylene glycol，PPG)共聚物，那么抑制活性提高到66%，而如果用等分子質(zhì)量的PPG 完全替換PEG 鏈，則能達到最大的抑制活性(92%)。而僅僅修飾PEG 頭部的基團，如接上一個油酸脂基團，則抑制活性不會增加。進一步實驗結(jié)果顯示，TPGS1000 與TPGS400 相比，在細胞穿透性試驗中對P-gp 底物——羅丹明123 的外排抑制明顯具有優(yōu)勢。(2)親脂部分，用色原烷醇或膽固醇替換α-生育酚，對P-gp 的抑制作用分別從33%提高到了62%和59%。如果去掉中間連接部分的琥珀酸，抑制活性也提高到63%，若直接用去氧膽酸或膽酸作為親脂部分，抑制活性提高到54%。有研究針對TPGS的衍生物，改變TPGS 疏水基團，用硫辛酸、葉綠醇、膽固醇代替原來結(jié)構(gòu)中的維生素E，結(jié)果證明，這些衍生物對P-gp 的抑制能力與TPGS1000 相比有了明顯變化。抑制作用由小至大依次為硫辛酸聚乙二醇1000 酯、葉綠醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯、TPGS1000、膽固醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯，其中膽固醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯具有明顯優(yōu)勢。表明表面活性劑親水親脂部分的改變對P-gp 的抑制效果具有決定性作用。

Zhao 等［13］合成了由PEG 和維生素D3組成的新型聚乙二醇維生素D3琥珀酸酯(cholecalciferol polyethylene glycol succinate，CPGS)。其與TPGS 有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)，Caco-2 細胞毒性實驗結(jié)果表明，CPGS 可增加阿霉素細胞毒性，推測可能與CPGS 抑制了P-gp 的藥泵作用有關(guān)。

6 TPGS 抑制P-gp 機制研究

Rege 等［14］研究了TPGS、Tween 80、Cremophor EL 等3 種非離子表面活性劑對Caco-2 細胞層上P-gp 的抑制作用，同時研究了細胞膜流動性在這個抑制過程中所起的作用。在羅丹明123 A-B 及從B-A 的雙向滲透性實驗中，Tween 80 和Cremophor EL 可顯著增加A-B 滲透，而使B-A 滲透減少，顯示二者均能明顯增加細胞膜流動性，而TPGS 僅使羅丹明123 在Caco-2 細胞層B-A 的滲透減少，細胞膜流動性變化不是很明顯。從分子層面進行分析顯示，只有當TPGS1000 濃度超過有效抑制濃度100 倍時，細胞膜流動性才略升高，即完全抑制外排的濃度遠小于使膜流動性改變的濃度［15］。TPGS 在抑制Pgp 過程中不會影響細胞膜流動性，也可以確定細胞膜流動性的改變不是抑制P-gp 外排作用的主要機制［16］。

Collnot 等［17］應(yīng)用單克隆CD243 P-gp 抗體(UIC2)研究P-gp的構(gòu)象轉(zhuǎn)化，進而對P-gp ATP 酶抑制機制進行研究。加入TPGS 后UIC2 的結(jié)合只是輕微減少，其對UIC2 結(jié)合的降低顯著弱于正釩酸鹽，表明在P-gp 泵轉(zhuǎn)運過程中TPGS 不是底物，并非通過搶占底物轉(zhuǎn)運結(jié)合位點達到抑制作用，也不是競爭性抑制劑，不通過變構(gòu)調(diào)節(jié)和空間位阻發(fā)揮抑制作用;P-gp 形態(tài)改變不是由于TPGS 直接作用于一個或兩個P-gp ATP 核苷酸結(jié)合區(qū)域。加入TPGS 后通過對胞內(nèi)ATP 的監(jiān)測，排除了ATP 排空機制。事實上TPGS 抑制的是底物誘導(dǎo)的ATP 酶活性。表明ATP酶活性的抑制是影響P-gp 外排功能的一個重要因素。

7 TPGS 對CYP3A4 抑制作用的研究

CYP3A4 是藥物Ⅰ相代謝的主要酶系，在腸道，其含量約占小腸CYP 總量的70%，位于人小腸的柱狀上皮細胞;P-gp 位于成熟腸細胞尖端表面的刷狀緣［18］。P-gp 的底物特異性很大程度上與CYP 相似，二者有很多重疊的底物，功能有協(xié)同作用，且已得到體內(nèi)、外試驗證實。機制是未被CYP3A4 代謝的藥物分子被P-gp 泵到腸腔后，這些物質(zhì)可重新被腸細胞吸收，而進一步被酶代謝，因而可再次暴露于CYP3A4，最終使藥物分子接觸代謝酶CYP3A4 的機會大大增加，促進了藥物的腸道代謝，明顯降低了底物藥物的吸收。同時，CYP3A4 代謝產(chǎn)物可能是P-gp 藥泵的底物，從而在腸道吸收過程中更難于透膜吸收，降低了藥物生物利用度。由此可以推測，TPGS 對CYP3A 也具有抑制作用［19］。

Johnson 等［11］研究表明，體外TPGS 能抑制CYP3A，其抑制作用強于酮康唑，在體內(nèi)，如果TPGS 與CYP 的底物合用時，可改變底物藥物動力學(xué)。也有研究采用小鼠腸腔組織作為模型研究TPGS 對CYP3A 的底物——維拉帕米代謝的影響。結(jié)果顯示，TPGS 在濃度為0.01% 時能顯著抑制代謝酶——CYP3A 的活性［20］。

8 TPGS 在抗癌藥物中抑制P-gp 的研究

TPGS 類似物因能形成膠束并可抑制P-gp 外排作用而被廣泛應(yīng)用于疏水性抗癌藥物中［21-24］。Varma 等［25］在紫杉醇乙醇溶液中分別添加Cremophor EL 和TPGS400，考察口服紫杉醇的絕對生物利用度，結(jié)果后者是前者的3.1 倍，因為TPGS 既可增加紫杉醇的溶解度，又能抑制P-gp，從而提高了紫杉醇的腸通透性。加入TPGS 后紫杉醇溶解度明顯提高，當其質(zhì)量濃度＞0.1 mg/ml時溶解度隨其含量增加呈線性增加，當TPGS 質(zhì)量濃度達到0.1 mg/ml 時能最大限度地提高了紫杉醇滲透性，有最大限度地抑制P-gp 外排活性，進一步增加TPGS 質(zhì)量濃度，A-B的滲透性降低，而從B-A 的滲透性不變。紫杉醇在大鼠回腸呈不對稱吸收，B-A 的吸收是A-B 的26 倍，加入維拉帕米(P-gp 抑制劑)后這種不對稱轉(zhuǎn)運有所減弱，充分證明紫杉醇是P-gp 外排作用的底物，且TPGS 確實可抑制P-gp 外排。另外，體內(nèi)藥動學(xué)實驗顯示，同時服用紫杉醇(25 mg/kg)和TPGS(50 mg/kg)后紫杉醇生物利用度能提高6.3 倍，而同樣條件下，維拉帕米對其生物利用度的提高僅為4.2 倍。

Dintaman 等［6］使用NIH3T3 細胞和人類MDRIcDNA 轉(zhuǎn)染的NIH3T3 細胞(G185)對紫杉醇、阿霉素、長春花堿、秋水仙堿和氟尿嘧啶的細胞毒性進行考察，NIH3T3 細胞上沒有P-gp，而G185 細胞上有，故G185 細胞抵抗紫杉醇、阿霉素、長春花堿、秋水仙堿細胞毒性是NIH3T3 細胞的27 ～135 倍，加入TPGS后可明顯提高這些藥物對G185 細胞的細胞毒性。然而，實驗結(jié)果顯示，加入TPGS 后氟尿嘧啶對G185 細胞和NIH3T3 細胞有等效的毒性，并沒有提高氟尿嘧啶對G185 細胞的細胞毒性，這是因為氟尿嘧啶不是P-gp 的底物［26］。

在醫(yī)藥領(lǐng)域，TPGS 是一種無毒、生物相容性好的多功能藥物輔料，已被FDA 批準為安全、有效的藥用輔料，且被收入美國藥典。在抗腫瘤方面，以其為輔料可抑制P-gp，從而提高藥物對腫瘤細胞的殺傷力，增加藥物的口服生物利用度。目前，TPGS作為P-gp 抑制劑的研究，已取得較好的效果，但其精確機制尚需進一步探討，其可與一些抗腫瘤藥合用，發(fā)揮協(xié)同療效。隨著對TPGS 性質(zhì)的不斷研究和P-gp 泵藥機制的深入了解，TPGS 作為腫瘤MDR 逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療具有極大的潛質(zhì)。

［1］ Abu Ajaj K，Kratz F. Development of dual-acting prodrugs for circumventing multidrug resistance［J］. Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2009，19(3):995.

［2］ 朱寶英，黃靜，王永林，等. P-糖蛋白及腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)［J］.中國藥房，2011，22(6):550-551.

［3］ 聞鎳，張雙慶，朱凌，等. P-糖蛋白最新研究進展［J］. 中國藥事，2011，25(7):718-723.

［4］ 胡大裕，李高，陳鷹.表面活性劑對腫瘤細胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的體外篩選［J］.中國藥師，2009，9(5):390-393.

［5］ 顧曉華，王軒，安磊，等.齊墩果酸/PLGA-TPGS 納米粒的制備及其體外釋放行為研究［J］.中國藥房，2012，23(29):2726-2728.

［6］ Dintaman JM，Silverman JA. Inhibition of P-glycoprotein by D—tocopherol polyethylene glycol succinate 1000(TPGS)［J］. Pharma Res，2009，16(10):1550.

［7］ Collnot EM，Baldes C，Wempe MF，et al. Influence of Vitamin E TPGS poly (ethylene glycol)chain length on apical efflux transporters in Caco-2 cell monolayers［J］. J Controlled Rel，2009，111(1/2):35.

［8］ Akhtar N，Ahad A，Khar RK，et al. The emerging role of Pglycoprotein inhibitors in drug delivery:a patent review［J］.Expert Opin Ther Patents，2011，21(4):561.

［9］ Lo YI. Relationships between the hydrophilic-lipophilic balance values of pharmaceutical excipients and their multidrug resistance modulating effect in Caco-2 cells and rat intestines［J］.J Controlled Rel，2009，90(1):37.

［10］ Bowman K，Erne-Brand F，Alsenz J，et al. The role of surfactants in the reversal of active transport mediated by multidrug resistance proteins［J］.Pharm Sci，2009，92(6):1250.

［11］ Johnson BM，Charman WN，Porter CJ. An in vitro examination of the impact of polyethylene glycol 400，Pluronic P85，and vitamin E d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate on Pglycoprotein efflux and enterocyte-based metabolism in excised rat intestine［J］.AAPS PharmSci，2012，4(4):E40.

［12］ Wempe MF，Wright C，Little JL，et al. Inhibiting efflux with novel nonionic surfactants:Rational design based on vitamin E TPGS［J］.Int J Pharm，2009，370(1/2):93.

［13］ Zhao HZ，Tan EC，Yung LY. Potential use of cholecalciferol polyethylene glycol succinate as a novel pharmaceutical additive［J］.J Biomed Mater Res A，2009，84A:954.

［14］ Rege BD，Kao JPY，Polli JE. Effects of nonionic surfactants on membrane transporters in Caco-2 cell monolayers［J］. Eur J Pharm Sci，2002，16(4):237-246.

［15］ Collnot EM，Baldes C，Wempe MF，et al.Mechanism of inhibition of P-glycoprotein mediated efflux by Vitamin E TPGS:influence on ATPase activity and membrane fluidity［J］. Mol Pharm，2009，4(3):465.

［16］ Yamagata T，Kusuhara H，Morishita M，et al. Effect of excipients on breast cancer resistance protein substrate uptake activity［J］. J Controlled Rel，2009，124(1/2):1.

［17］ Collnot EM，Baldes C，Schaefer UF，et al. Vitamin E TPGS Pglycoprotein inhibition mechanism:influence on conformational flexibility，intracellular ATP levels，and role of time and site of access［J］.Mol Pharm，2010，7(3):642.

［18］ 陳欣，李玉珍，方翼.CYP3A4 代謝藥物的特點及其多態(tài)性的研究現(xiàn)狀［J］.中國藥房，2010，21(22):2097.

［19］ 吳麗花，馬萌.腸壁CYP3A4 和P-糖蛋白與口服藥物生物利用度［J］.中國藥房，2003，14(7):437.

［20］ Mudra DR，Borchardt RT. Absorption barriers in the rat intestinal mucosa.3:effects of polyethoxylated solubilizing agents on drug permeation and metabolism［J］.Pharm Sci，2010，99(2):1016.

［21］ Xiao L，Xiong X，Sun X，et al. Role of cellular uptake in the reversal of multidrug resistance by PEG-b-PLA polymeric micelles［J］.Biomaterials，2011，32(8):5148-5157.

［22］ Mi Y，Liu Y，F(xiàn)eng S-S. Formulation of docetaxel by folic acidconjugated D-atocopheryl polyethylene glycol succinate 2000(vitamin E TPGS2k )micelles for targeted and synergistic chemotherapy［J］.Biomaterials，2011，32(16):4058-66.

［23］ Huijun Zhu，Hongbo Chen，Xiaowei Zeng，et al. Co-delivery of chemotherapeutic drugs with vitamin E TPGS by porous PLGA nanoparticles for enhanced chemotherapy against multi-drug resistance［J］.Biomaterials，2014，35(7):2391-2400.

［24］ Zhao HZ，Yung LYL. Addition of TPGS to folate-conjugated polymer micelles for selective tumor targeting［J］. J Biomed Mater Res A，2009，91(2):505-18.

［25］ Varma MV，Panchagnula R. Enhanced oral paclitaxel absorption with vitamin E-TPGS:effect on solubility and permeability in vitro，in situ and in vivo［J］.Eur J Pharm Sci，2013，25(4-5):445.

［26］ T Traber，M. G.，Kayden，H. J.，Green，J. B.，Green，M. H.Absorption of water-miscible forms of Vitamin E in a patient with cholestasis and in choracic duct cannulated rats. Am［J］. J Clin Nutr，2012，44(6):914.