姚鳳霞，馮 暄，張為民，韓娟娟，黃尚志

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 中心實驗室， 北京 100730； 2.甘肅省婦幼保健院 遺傳室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 遺傳室， 北京 100005)

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研究論文

一種脆性X綜合征新檢測方法的應(yīng)用及探討

姚鳳霞1*，馮 暄2，張為民1，韓娟娟1，黃尚志3

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 中心實驗室， 北京 100730； 2.甘肅省婦幼保健院 遺傳室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 遺傳室， 北京 100005)

目的建立一種更快捷、準(zhǔn)確、簡便的檢測脆性X綜合征的方法。方法用傳統(tǒng)的基因組酶切-PCR法與TP-PCR法同時對26例可疑患兒進(jìn)行基因檢測。結(jié)果基因組酶切PCR法共檢測4例男性患者，其余均未見異常；TP-PCR法不僅檢測出4例男性患者，且檢測出1例女性攜帶者。結(jié)論TP-PCR法是一種準(zhǔn)確、快速、簡便和相對價廉的方法，可以快速篩查脆性X綜合征的基因診斷方法。

脆性X綜合征；FMR1基因；基因診斷

脆性X綜合征(MIM：309550)是一種主要以智力低下為臨床表現(xiàn)的X連鎖隱性遺傳性疾病，其發(fā)病率男性1/1500[1]。絕大多數(shù)脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制為FMR1基因5′端非翻譯區(qū)(CGG)n三核苷酸重復(fù)序異常傳遞而引起[2]。FMR1基因(CGG)n重復(fù)拷貝數(shù)正常人群為6～52；當(dāng)(CGG)n重復(fù)為53～200拷貝數(shù)時為前突變, 見于正常男性傳遞者及女性攜帶者； 而當(dāng)重復(fù)拷貝數(shù)超過200為全突變, 此時, 位于(CGG)n上游250 bp處的CpG島多伴有異常甲基化導(dǎo)致此病的發(fā)生[3]。前突變經(jīng)過逐代遺傳有可能變成全突變，并且隨著突變數(shù)的增加前突變轉(zhuǎn)變?yōu)槿蛔兊母怕蕰黾印?/p>

脆性X綜合征需要從基因水平得以確診，目前的實驗室檢測方法主要包括Southern印記雜交法、基因組DNA特異性酶切、RNA水平PCR法等，以上方法均存在一定的不足。本文對本實驗室新舊方法做對比，尋找一種更為快速、精準(zhǔn)的方法來診斷脆性X綜合征病例。

1 材料與方法

1.1 研究對象和DNA提取

26例臨床均表現(xiàn)為智力低下的患者和母親為北京協(xié)和醫(yī)院兒科遺傳咨詢門診病例，經(jīng)本人或監(jiān)護(hù)人知情同意后采集外周靜脈血3 mL。26例樣本中包含21例為男性病例，5例為女性病例,5例女性樣本中包含2例可疑患兒的母親。正常男女對照均選用實驗室收集的無智力低下的其他疾病患者。外周血使用基因組DNA 提取試劑盒(qiagen blood DNA mini Kit) 抽提DNA，加入適量的TE 液，充分溶解DNA，核酸定量儀測定DNA濃度，使其控制在50～200 ng/μL,-20 ℃保存。推薦DNA模板濃度在20～80 ng/μL,80 ng/μL最佳。

1.2 基因組酶切PCR法檢測

為了驗證AmplideXTMFMR1 PCR試劑盒檢測脆性X綜合征患者結(jié)果的準(zhǔn)確性，將26例病例全部用實驗室以前采用的方法即應(yīng)用患者FMR1基因異常甲基化的特點通過EagⅠ酶酶切待測者的基因組DNA，以酶切產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR。具體操作是每個樣品分別取200 ng基因組DNA與酶切緩沖液混合，其中一管加入適量EagⅠ限制性內(nèi)切酶(Newland公司)，另一管不加入酶，最后用去離子水定容至20 μL，以上混合液37 ℃水浴酶切過夜。使用FMR1基因特異引物對(5′-AGTGCGACCTG TCACCGCCCTTC-3′和5′-GAAACCACGTCACGTGAT CAA-3′)和內(nèi)對照D2S2163引物進(jìn)行PCR合成，具體PCR體系的設(shè)置為:酶切產(chǎn)物4 μL、GC緩沖液Ⅱ 12.5 μL, dNTP(0.25 mmol/L)2 μL, FMR1和D2S2163引物對各1 μL,25×105U/L DNA聚合酶0.5 μL，最后加水至25 μL。PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s擴(kuò)增30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃充分延伸10 min。 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色檢測。

1.3 TP-PCR及毛細(xì)管電泳

15 μL PCR反應(yīng)體系中分別加入GC緩沖液11.45 μL, FMR1引物對0.5 μL,FMR1 CGG特異引物0.5 μL, PCR聚合酶0.05 μL,最后加DNA模板2 μL，以上試劑均包含在AmplideXTMFMR1 PCR試劑盒(Asuragen公司)中。配制完成的PCR反應(yīng)液充分混勻后運行PCR程序， 95 ℃變性5 min,然后(97 ℃ 35 s,62 ℃ 35 s,68 ℃ 4 min)進(jìn)行10個循環(huán)，再進(jìn)行(97 ℃ 35 s,62 ℃ 35 s,68 ℃ 4 min)20個循環(huán)，此間每個循環(huán)再加20 s,之后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。取2 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與11 μL的HiDi甲酰胺和2 μL的ROX1000相對分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)充分混勻后，置熱循環(huán)儀95 ℃變性2 min，立即放入冰盒中至少2 min。在ABI 3130型基因分析儀上經(jīng)36 cm毛細(xì)管電泳分離。由于PCR體系中含有FMR1基因的熒光引物，同時含有針對CGG重復(fù)的熒光引起，對于基因組中出現(xiàn)異常(CGG)n的樣本，不僅可以檢測到FMR1的主峰片段，同時可檢測到CGG錨定引物所擴(kuò)增的CGG重復(fù)產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示為“鋸齒”狀的CGG重復(fù)峰。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

TP-PCR實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)過Genemapper4.0軟件進(jìn)行分析獲得。CGG重復(fù)數(shù)的計算=(主峰值-C0)/M0,其中C0為核苷酸長度的校正值，M0為動態(tài)校正因子。

2 結(jié)果

2.1 基因組酶切PCR結(jié)果

有4例男性樣品由于異常甲基化基因組DNA不能被EagⅠ限制性內(nèi)切酶所切割，未切組和酶切組均可見FRM1基因擴(kuò)增片段，5例女性樣本和其余17例男性樣本基因組DNA由于含有正常的CGG重復(fù)基因組而被EagⅠ限制性內(nèi)切酶切割，未切組和酶切組比較，酶切組PCR擴(kuò)增未見FRM1基因特異片段，只擴(kuò)增出內(nèi)對照片段；而未切組PCR后則可見FRM1基因片段和內(nèi)對照片段(圖1)。

2.2 TP-PCR檢測結(jié)果

經(jīng)過對標(biāo)準(zhǔn)CGG重復(fù)數(shù)為20、29、31、54和119對應(yīng)的主峰面積，建立線性回歸方程y=m0x+c0,得出本實驗室m0=2.936，c0=229.6，R2=0.999(圖2)。

1,3,5,7,9,11,13,15.PCR products not cut by restriction endonuclease; 2,4,6,8,10,12,14,16.PCR products not cut by restriction endonucleass; ～300 bp band for D2S2163 and ～250 bp band for FMR1; normal for A and B, patients for C～F

圖1 6個待檢樣品用基因組酶切法檢測的瓊脂糖電泳結(jié)果圖

Fig 1 Agarose gel of genomic restriction endonuclease-PCR technology for 6 samples

圖2 脆性X綜合征CGG重復(fù)數(shù)與主峰長度線性回歸圖Fig 2 Linear regression graph between CGG repeat numbers and main peak length

對26個樣品直接TP-PCR顯示， 4例男性樣品和1例女性樣品均可見“鋸齒”狀CGG異常重復(fù)峰和異常增大的FMR1主峰片段(1 kb以上)，其余21例樣品的FMR1主峰均在250～300 bp之間，且未見CGG重復(fù)峰(圖3)。

3 討論

脆性X綜合征是一種以智力低下為主要臨床表現(xiàn)的X連鎖隱性遺傳病，該病是常見的引起智力低下的病因之一。早在1991年研究發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征的發(fā)病分子基礎(chǔ)為位于Xq27.3上的FMR1基因上游的(CGG)n拷貝數(shù)異常導(dǎo)致的[4]。

A.male patient; B.normal mal; C.female carrier

Southern印跡雜交目前雖是FMR1甲基化狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，但Southern印跡雜交法最大的缺點是對基因組DNA質(zhì)量和數(shù)量的要求苛刻，且操作程序復(fù)雜，敏感性不穩(wěn)定。另外，Southern印跡雜交對于準(zhǔn)確的前突變和正常序列之間區(qū)分的能力較弱[5]?；谟∮涬s交方法的不足，基因組DNA首先被甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶如EagⅠ酶切后，PCR檢測(CGG)n拷貝數(shù)。此方法存在酶切不徹底、受高CG含量序列和PCR條件要求高的不足，同時，只能定量分析男性樣本，由于女性兩條X染色體中總會存在一條FMR1基因拷貝數(shù)正常，所以對于女性樣本無法檢測[6]。

為了克服以上實驗技術(shù)的不足， 2012年開發(fā)了一種TP-PCR (CGG triplet-repeat primed (TP)-PCR)方法檢測脆性X綜合征的診斷方法assay[7]。TP-PCR方法的優(yōu)勢主要在于：1)實驗操作簡便，只需通過一次的PCR擴(kuò)增，之后行1次毛細(xì)管電泳即可完成； 2)此方法具有超強(qiáng)的擴(kuò)增體系，可擴(kuò)增>1 300的CGG重復(fù)； 3)對于<200CGG重復(fù)，可以算出精確重復(fù)數(shù)，>200CGG重復(fù)，標(biāo)注為“>200”；4)精確區(qū)分1個CGG的差異； 5)獨創(chuàng)“錨定引物”PCR擴(kuò)增，可判斷出女性基因是雜合子還是純合子，以及AGG嵌入數(shù)，AGG被認(rèn)為傳遞了DNA的穩(wěn)定性，它的存在降低了后代發(fā)病的風(fēng)險； 6)此方法的靈敏度是Southern雜交的5倍，DNA需要量是Southern雜交的1/175。本文圖3顯示A樣本為CGG拷貝數(shù)為285的男性全突變患者；B樣本為CGG拷貝數(shù)為23的男性正常樣本而C樣本為CGG拷貝數(shù)為23和285的女性全突變攜帶者。

本方法針對脆X綜合征特殊的分子基礎(chǔ)進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，能確切檢出正常、前突變攜帶者及全突變患者，以及女性患者及攜帶者，具有快速、安全、經(jīng)濟(jì)等特點，且無放射性污染問題，優(yōu)于上述的其他方法。由于診斷方法簡單及費用合理，可用于脆X綜合征的群體篩查和產(chǎn)前診斷，有良好的臨床應(yīng)用前景。

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[4] Verkerk AJ，Pieretti M，Sutcliffe JS，etal.Identification of a gene(FMR- 1)containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in Fragile X syndrome[J].Cell, 1991，65：905- 914.

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Application and investigation of a new genetic technology for fragile X syndrome

YAO Feng-xia1*, FENG Xuan2, ZHANG Wei-min1, HAN Juan-juan1, HUANG Shang-zhi3

(1.Clinical Research Lab, PUMC Hospital, CAMS, Beijing 100730; 2.Medical Genetics Lab, Maternal and Child Health Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730050; 3.Dept. of Medical Genetics, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

Objective To establish a rapid, correct and available detection method for fragile X syndrome. Methods We used AmplideXTMFMR1 PCR Kit to detect samples from 26 suspected patients including 21 male and 5 female patients. All patients were also studied by using genomic EagI restriction enzyme PCR method for comparison. Results (CGG) n trinucleotide repeat of normal samples was accurately identified by PCR method. There are 5 positive patients of fragile X syndrome which included by 4 full mutation patients and 1 female carrier by TP-PCR while the control method found 4 positive men patients only. Conclusions TP-PCR is a accurate, rapid, simple and inexpensive method. It is a competetive technology for screening fragile X syndrome.

fragile X syndrome;FMR1 gene; gene diagnosis

2014- 03- 04

2014- 12- 29

國家自然科學(xué)基金(81000252)

1001-6325(2015)04-0454-04

R394.3：

A

*通信作者(corresponding author)：fxyao77@163.com