周 游，譚 穎，張文君，劉 琳，趙 瑛

(哈爾濱商業(yè)大學藥學院，哈爾濱150076)

隨著糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)發(fā)病率的快速上升，其引起的認知損害也正在引起廣泛關(guān)注[1－2].關(guān)于糖尿病認知功能損害，現(xiàn)在學術(shù)界公認的觀點認為與腦老化及癡呆有密切關(guān)系，癡呆是以腦內(nèi)β－淀粉樣多肽(β－amyloid，Aβ)產(chǎn)生和清除這兩者失衡有關(guān)[3].早在20世紀就已經(jīng)出現(xiàn)關(guān)于糖尿病認知功能損害的報道，但目前糖尿病認知功能損害的藥物治療仍然處于探索階段，至今尚無一個有效的藥物用于臨床.小檗堿自20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)其在糖尿病治療上的療效以來，很多學者就其調(diào)節(jié)血糖、改善胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等作用進行大量臨床觀察及實驗研究，研究表明，小檗堿對胰島素抵抗、糖代謝紊亂等均有良好的干預(yù)作用[4－5].已知糖尿病認知障礙的發(fā)生機制涉及胰島素信號受損、糖代謝受損、氧化應(yīng)激、炎癥等方面，故本課題選用小檗堿作為受試藥物，通過測定其對認知功能障礙核心病理特征Aβ質(zhì)量濃度的影響，從而為糖尿病認知損害的藥物干預(yù)提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級Wistar大鼠，雄性60只，體重(200±20)g，8～10周齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2012－0001.普通飼料配方如下:53%玉米粉，24%豆餅粉，16%麥麩，5%魚粉，1%骨粉，1%食鹽.高脂飼料配方如下:豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鈉0.5%，基礎(chǔ)飼料78.5%，購于黑龍江中醫(yī)藥大學.

1.2 主要試劑

葡萄糖測定試劑盒(購自長春匯力生物科技有限公司，批號120912);胰島素放射免疫分析試劑盒(購自濰坊三維生物工程集團有限公司，批號121229);鏈脲佐菌素(Sigma分裝，批號S0130，購自北京博愛科貿(mào)有限公司);吡咯列酮(荔諾生物，批號201012);小檗堿(大連美倫生物科技有限公司，批號201203).

1.3 主要儀器

酶標分析儀 (RAYTO公司，型號 RT－6000);低溫高速離心機(Sigma公司，3K30公司);雙蒸水機(上海亞榮生化儀器廠，型號SZ－93A);超低溫冰箱(SANYO公司);電子天平(上海躍平科學儀器有限公司，型號FA－1004B).

2 實驗方法

2.1 糖尿病模型的復(fù)制

普通食水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠按體重隨機分為2組:空白組(n=15)、高脂組(n=45).其中模型組給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)8周.然后，禁食不禁水16 h，以冰浴的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液將STZ粉末溶解，新鮮配制1%的STZ溶液，模型組按照給藥劑量35mg/kg腹腔注射，冰上避光操作，10 min內(nèi)注射完畢，復(fù)制具有外周胰島素抵抗的糖尿病模型.空白組腹腔注射同劑量檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液.注射STZ 72h后眼底靜脈叢取血檢測空腹血糖、空腹血胰島素水平，計算胰島素敏感指數(shù)，選擇空腹血糖≥16.7mmol/L動物納入實驗[6].

2.2 動物分組給藥

糖尿病模型組大鼠依據(jù)血糖隨機分為模型組(n=12)、小檗堿高劑量組(n=10)對小檗堿高劑量組(n=10)和吡咯列酮組(n=10).給藥期間，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，同時以蒸餾水灌胃;模型組給予高脂飼料，同時以蒸餾水灌胃;小檗堿高、低劑量組給藥劑量分別為 129.45mg/kg·d、64.72mg/kg·d，吡咯列酮組給藥劑量為2.72 mg/kg·d，各藥物組同時給予高脂飼料.以上各組每日灌胃1次，給藥持續(xù)8周至動物處死.

2.3 標本制備

2.3.1 血漿樣本

實驗期間，采用眼底靜脈叢進行取血，時間點分別是:高脂飼料喂養(yǎng)8周、腹腔注射1%STZ 72 h、藥物治療8周時.所有大鼠禁食不禁水過夜16 h，然后球后靜脈叢取血 1.5 mL，離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，吸取上清，－80 ℃凍存待測.

2.3.2 腦組織樣本

于小檗堿給藥8周后取材，各組大鼠3%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，立即斷頭處死，在冰盤上快速取腦，去除腦干及小腦，置0～4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準確稱重，迅速放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入重量體積比(1∶9)的冰冷生理鹽水，0～4℃條件下快速勻漿.組織被均勻粉碎后在恒溫下進行離心(5 000 r/min，10 min，4℃)，吸取上清待測.

2.4 糖尿病大鼠觀察指標

2.4.1 動物一般狀態(tài)觀測

整個實驗過程中觀察動物活動情況、毛色，每天監(jiān)測動物的進食量、飲水量.

2.4.2 糖尿病大鼠代謝籠的測定

實驗過程中每天觀察大鼠的一般狀態(tài)，每隔30d采用代謝籠測定動物攝食、飲水量、糞便量和尿量，每只動物晚19:00給定量的食水，至次日上午7:00測量剩余量，兩者的差值即為每只大鼠每12h的飲食、水量，通過代謝籠稱量大鼠糞便重量和尿液體積.

2.4.3 血糖濃度 (FBG)測定

實驗前，更換墊料，禁食16 h，自由飲水.大鼠乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血0.5 mL，肝素抗凝，離心(3 000 r/min，10 min)，分離血漿待測.吸取上清，采用葡萄糖氧化法測定空腹血糖.

2.4.4 血胰島素濃度 (FINS)測定

方法同上，采用放射免疫分析法測定血漿胰島素的含量.

2.4.5 胰島素敏感指數(shù) (IAI)

計算公式為:IAI=ln[1/(FPG×FINS)].

2.4.6 血中、腦中 Aβ40、Aβ42 質(zhì)量濃度測定

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定，Aβ質(zhì)量濃度以兩者之和計算.具體操作按試劑盒說明書嚴格操作進行.

2.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0 For Windows統(tǒng)計軟件進行處理.結(jié)果用平均值±標準差()表示，采用單因素方差分析.P＜0.05說明有顯著性差異，P＜0.01說明有非常顯著性差異.

3 實驗結(jié)果

3.1 高脂飲食對大鼠體重的影響

與空白組相比，高脂飼料喂養(yǎng)8周，高脂組大鼠體重增加較快，體重由(231.72±11.63)g增加至(342.89 ±42.32)g(P ＜0.01).一次性腹腔注射1%STZ 72 h 后，體重下降(P ＜0.05).見表1.

表1 高脂飲食對大鼠體重的影響(g，±s)

表1 高脂飲食對大鼠體重的影響(g，±s)

與空白組比較，*P＜0.05有顯著性差異，＊＊P＜0.01有非常顯著性差異

組別 N 1周 6周 8周 STZ 72h(g)空白組 12 227.79 ±21.94 284.89 ±33.37 304.76 ±37.45 312.89 ± 34.23高脂組 42 231.72 ±11.63 317.85 ±40.86＊＊ 342.89 ±42.32＊＊ 324.34 ±26.77*

3.2 高脂飲食對大鼠血糖、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響

結(jié)果表明:與空白組相比，高脂組大鼠血糖顯著增高(P＜0.01)，胰島素非常顯著增高(P＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)顯著降低(P＜0.05).結(jié)果提示，長期高脂飲食已經(jīng)造成外周胰島素顯著增加，胰島素敏感指數(shù)降低，大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象，血糖增高(P ＜0.05).見表2.

表2 高脂對血糖、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響(±s)

表2 高脂對血糖、胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響(±s)

與空白組比較，*P＜0.05有顯著性差異，＊＊P＜0.01有非常顯著性差異

胰島素敏感指數(shù)組別 N 血糖mmol/L胰島素μIU/L空白組12 4.73 ±1.58 21.19 ±6.14 －4.57 ±0.46高脂組 42 7.81 ±1.18*34.79 ±6.74＊＊－6.26 ±0.58*

3.3 糖尿病大鼠糖代謝指標

與空白組相比，腹腔注射1%STZ 72 h后，糖尿病大鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、毛發(fā)散亂、枯黃，稀便、食水攝入增加、體重減輕等狀態(tài)，這與臨床上糖尿病患者癥狀表現(xiàn)類似.

3.3.1 糖尿病大鼠代謝籠的變化

結(jié)果表明:與空白組相比，模型組大鼠腹腔注射STZ后飲水量、飲食量、糞便量、尿量都顯著性增加(P ＜0.05;P ＜0.01).見表3.

表3 糖尿病大鼠飲食量，飲水量，尿量，糞便量(±s)

表3 糖尿病大鼠飲食量，飲水量，尿量，糞便量(±s)

與空白組比較，*P＜0.05有顯著性差異，＊＊P＜0.01有非常顯著性差異

組別 N 飲食量(g/d)飲水量(mL/d)尿量(mL/d)糞便量(g/d)空白組 12 11.28 ±3.07 47.18 ±17.14 23.45 ±12.24 5.29 ±1.25模型組 37 18.72 ±0.58* 100.50 ±23.30＊＊ 69.41 ±20.92＊＊ 10.57 ±2.19＊＊

3.3.2 糖尿病大鼠血糖、胰島素的變化

實驗結(jié)果表明:高脂大鼠腹腔注射STZ后，與空白組比較，空腹血糖顯著增加(P＜0.01)，血清胰島素變化不顯著.見表4.

表4 糖尿病大鼠血糖、胰島素的含量

3.4 小檗堿對糖尿病大鼠Aβ的改善作用

結(jié)果表明:與空白相比，模型組大鼠腦內(nèi)Aβ顯著性增加(P＜0.01);與模型組組比較，小檗堿高劑量組能顯著性降低腦中Aβ的質(zhì)量濃度(P＜0.01)，小檗堿低劑量組有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義.吡咯列酮組有顯著性差異(P＜0.05).見表5.

表5 小檗堿對血中與腦內(nèi)Aβ的影響(pg/mL，±s)

表5 小檗堿對血中與腦內(nèi)Aβ的影響(pg/mL，±s)

與空白組比較，*P＜0.05有顯著性差異，＊＊ P ＜0.01有非常顯著性差異與模型組比較，△P＜0.05有顯著性差異，△△P ＜0.01有非常顯著性差異

組別 N 血Aβ 腦Aβ 10 116.92 ±5.61 200.99 ±5.59模型組 9 125.61 ±7.12＊＊ 999.22 ±85.08＊＊小檗堿高劑量 9 113.28±4.71△△ 201.29±19.11△△小檗堿低劑量 10 122.47 ±2.78 691.33 ±73.53吡咯列酮 9 116.98±3.39△ 653.69±58.63空白組△

4 討論

隨著社會老年化日益顯著，糖尿病和癡呆是影響老年人健康的主要兩大疾患.臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者及胰島素抵抗的慢性高胰島素血癥患者，其認知功能減退甚至癡呆發(fā)生的危險性均顯著增高[7].研究顯示，胰島素抵抗與癡呆的病理生理特征密切相關(guān)，而在癡呆形成過程中以大腦皮層及海馬區(qū)的Aβ的沉積為核心病理特征.基于以上的認識，本課題研究的是伴有胰島素抵抗過程的糖尿病形成過程中Aβ的變化.

本實驗采用高脂飲食喂飼聯(lián)合小劑量35 mg/kg腹腔注射1%STZ的方法建立糖尿病模型.實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，高脂喂飼8周后，IAI顯著性降低，F(xiàn)PG顯著升高但未達到16.7 mmol/L，此時誘發(fā)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗是糖尿病早期缺陷.此時大鼠的胰島素水平雖高于正常，但它與胰島素受體的結(jié)合能力以及受體后的效應(yīng)均減弱，故而出現(xiàn)高胰島素血癥.

本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病成模后，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，活動度低，抓起時明顯排便反應(yīng)，皮毛無光澤，枯黃等現(xiàn)象，本實驗結(jié)果提示:與空白組相比，糖尿病大鼠8周時，腦內(nèi)與血中Aβ明顯增加，表明糖尿病能促進大鼠腦內(nèi)和血中Aβ的生成.

研究表明，具有胰島素增敏作用中藥單體小檗堿能夠改善胰島素抵抗過程中的糖脂代謝指標及其胰島素信號傳導過程中的相關(guān)分子，作用明確[8－9].本次實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以降低糖尿病大鼠腦內(nèi)和血中Aβ的質(zhì)量濃度，目前已知小檗堿具有明顯的改善糖尿病糖脂代謝，改善胰島素抵抗，那么小檗堿能否通過改善糖脂代謝來發(fā)揮降低腦內(nèi)和血中Aβ的作用呢?需要進一步研究進行證實.

實驗期間，小檗堿高劑量組個別動物出現(xiàn)攝食減少，精神狀態(tài)萎靡，毛色枯黃等現(xiàn)象，死亡動物臟器肉眼檢查主要表現(xiàn)為各腸段脹氣較明顯，腹部脹氣嚴重，腸壁變薄，胃部脹大，內(nèi)部有食物殘留，其余臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯病變.雖然小檗堿有原料易獲得等優(yōu)點但其不良反應(yīng)也限制其在臨床上的應(yīng)用，在今后的實驗中，小檗堿應(yīng)在改善劑型及給藥途徑等方面做進一步研究.

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