薛源++李巖++徐思

摘 要：miRNA調控機體對訓練應激的適應能力，其調控模式影響有氧耐力可訓練性。循環(huán)miRNA（c-miRNA）與miRNA密切相關，分析不同有氧耐力可訓練性水平群體的運動適應性c-miRNA表達變化差異，可獲得與訓練敏感性相關的c-miRNA表達譜特征。結果顯示：高可訓練性表型在有氧訓練應激誘導下差異表達17條c-miRNA，其中11條上調，6條下調或平穩(wěn)，其調控功能主要涉及低氧適應通路和脂肪酸β氧化代謝的關鍵基因表達。提示：有氧耐力可訓練性差異與機體低氧適應能力和脂肪酸β氧化供能能力，對有氧訓練應激誘導作用的反應性密切相關。miRNA調控并整合機體應激適應性基因表達。c-miRNA差異表達譜可用來評估有氧耐力可訓練性，預測有氧能力發(fā)展?jié)摿Α?/p>

關 鍵 詞：運動生物化學；有氧耐力；可訓練性；循環(huán)微核苷酸；最大攝氧量；關聯(lián)模型；

運動性適應

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2015）04-0139-06

Correlation between aerobic endurance trainability difference and the expression

spectrum characteristics of sport adaptive circulating microRNA

XUE Yuan1，LI Yan2，XU Si3

（1.School of Physical Education，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；

2.School of Physical Education，Ludong University，Yantai 264025，China；

3.Sichuan Academy of Medical Science，Sichuan Provincial Hospital，Chengdu 610031，China）

Abstract： miRNA regulates the bodys ability to adapt to training stress； its regulating pattern affects aerobic endurance trainability. Circulating miRNA （c-miRNA） is closely related to miRNA； by analyzing differences in the changing of sport adaptive c-miRNA expression of groups of people at different aerobic endurance trainability levels， the authors can acquire the expression spectrum characteristics of c-miRNA sensitively correlative with training. Results： induced by aerobic training stress， the phenotype with high trainability differentially expressed 17 c-miRNAs， 11 of which were up-regulated， 16 of which were down-regulated or steady， its regulating function mainly involved with hypoxia adaptation pathway and the key gene expression of fatty acid β-oxidation metabolism. Hint： aerobic endurance trainability difference is close related to the reactivity of the bodys hypoxia adaptation ability and fatty acid β-oxidation energy supply ability to the induction function of aerobic training. miRNA regulates and integrates the bodys stress adaptive gene expression. C-miRNA differential expression spectrum can be used to evaluate aerobic endurance trainability， and to predict aerobic ability development potential.

Key words： sports biochemistry；aerobic endurance；trainability；c-miRNAs；maximum oxygen uptake；correlation model；sports adaption

杰出運動能力的形成與運動天賦和長期刻苦訓練密不可分。運動性適應能力好的運動員的可訓練性更強，成績提高更快，訓練效果更好[1]。表觀遺傳學機制調控營養(yǎng)、訓練等環(huán)境應激因素誘導的適應過程的基因選擇性表達，其基因調控模式具有個體差別并可穩(wěn)定遺傳[2]，可能是產生運動能力及可訓練性個體差異的原因。目前對于表觀遺傳學基因調控模式與運動能力的可訓練性的具體關聯(lián)所知甚少，因而無法將其作為指標應用于運動員選材和個性化訓練。

microRNA基因表達調控作用是環(huán)境應激適應性基因表達的主要表觀遺傳學調控方式[3]，其調控模式與環(huán)境應激適應能力的個體差異有關，應激適應過程中的microRNA表達譜反映了其調控模式和強度[4]。研究表明，microRNA分子（以下簡稱miRNA）參與了運動性適應基本生理過程的調控，如肌組織肥大和心肌/骨骼肌收縮力增強[5]、血管增生[6]、線粒體合成與酶活性提高[7]等。組織內miRNA分泌進入血液循環(huán)成為循環(huán)miRNAs（circulating miRNAs，以下簡稱c-miRNA），二者在表達譜上具有穩(wěn)定關聯(lián)[8]。c-miRNA可能是運動應激誘導機體應答過程中整合多系統(tǒng)適應性反應的關鍵因子[9]，其表達譜特征與運動訓練方式和訓練效果存在關聯(lián)，在運動性適應的不同狀態(tài)下，c-miRNAs表達譜發(fā)生特征性改變[10]，因此推測：運動適應性c-miRNAs表達譜可以作為反映運動能力的可訓練性的“分子指紋”，在選材階段準確預估運動能力的發(fā)展?jié)摿?，或用來評估訓練效果/競技狀態(tài)，作為制訂個性化訓練方案的依據(jù)。

有氧耐力水平是決定運動能力的主要因素之一，不同個體的有氧耐力訓練效果存在顯著差異[11]。本研究以最大攝氧量（VO2max）為主要指標評估有氧耐力訓練效果和訓練敏感性，同步檢測運動適應性c-miRNA表達譜，提取和分析有氧耐力訓練的高敏感表型個體的運動性適應c-miRNA表達譜特征，建立運動性適應c-miRNA表達譜與有氧運動能力訓練敏感性的關聯(lián)模型，作為早期預測和評估有氧運動能力發(fā)展?jié)摿瓦m應特點的指標應用于運動員選材和個性化訓練方案制訂。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

四川省某文武學校初中部學員92人，男性，平均年齡（13.6±0.5）歲；身高（171.85±6.28）cm；體重（59.60±4.55） kg。既往健康，無傷病史，參加試驗前未受過系統(tǒng)的有氧運動能力訓練。

1.2 有氧耐力訓練方案

參加實驗學員進行為期15周的系統(tǒng)性有氧運動能力訓練。每周三、五下午16：00-17：30進行5 000 m長跑訓練，負荷強度：1～3周65%個人最大心率±3次/min；4～10周70%個人最大心率±3次/min；11～15周75%個人最大心率±3次/min。以polar表（瑞典產）監(jiān)控靶心率維持速度。訓練方案由教練監(jiān)督執(zhí)行。

1.3 有氧運動能力相關指標檢測

所有指標在15周有氧耐力訓練前后各檢測1次，分別記為基礎值（baseline）和訓練值（post-ex）。

1）最大攝氧量相對值（R-VO2max）測試采用12 min跑法[12]，在400 m標準跑道上進行，受試者佩戴polar表，按指令起跑，盡最大努力跑完12 min，讀取跑動距離s并換算成英里，按以下公式折算成R-VO2max：

R-VO2max（mL/（min·kg））=（s-0.318）/0.0278 ①

2）個體乳酸閾（ILT）測定采用遞增負荷法[13]，功率自行車（瑞典產Monark894E、839E）起始負荷為50 W，每2 min遞增40 W，轉速維持在50 r/min，直至力竭（力竭標準：連續(xù)2次不能維持規(guī)定轉速）。取中指指尖血20 μL，采用YSI1500便攜式血乳酸自動分析儀測定血乳酸值。分別采取安靜狀態(tài)下、每級負荷后即刻及恢復期第2、5、8、10、15 min血樣。測試結果記錄在表中，采用Stegmann方法判定ILT[14]。

1.4 c-miRNA表達譜檢測和實時熒光定量PCR法驗證

1）c-miRNAs表達值測定。

15周有氧耐力訓練開始前清晨空腹安靜狀態(tài)下肘靜脈取血5 mL檢測c-miRNAs表達值，記為基線表達值。完成VO2max基礎值測試后分別于1 h內、恢復24和48 h肘靜脈取血5 mL檢測c-miRNAs表達值，記為測試后0、恢復24 h、恢復48 h表達值。

2）血漿總RNA提取。

TRIZOL法提取血漿總RNA，RNase-free ddH2O溶解提取的總RNA分子。紫外分光光度儀測定RNA純度和濃度，OD 260/280>1.9說明總RNA純度較好，②甲醛變性瓊脂糖電泳檢測總RNA完整性較好，未發(fā)生降解。

3）microarray檢測c-miRNA差異表達譜。

總RNA按照Ambions miRNA Isolation Kit說明書分離miRNA。使用miRCURYTM Array Labelling kit（Ambion）進行miRNA標記操作。microRNA芯片雜交按照miRCURYTM Array microarray kit （Exiqon）說明書進行。Genepix 4000B雙通道激光圖像掃描儀（Molecular Devices公司）以635 nm單波長進行掃描，Genepix Pro 6.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預處理以后，根據(jù)各張芯片的global mean 進行片間校正，用SAM （significance analysis of microarrays，SAM .version2.1）篩選差異表達miRNAs。篩選條件：FDR （false discovery rate）<5%，F(xiàn)old change>2或<0.5。

4）實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證差異表達c-miRNA相對表達量。

（1）c-miRNA莖環(huán)反轉錄合成cDNA：根據(jù)mirBASE提供的miRNA種子區(qū)序列，設計莖環(huán)反轉錄引物（北京六合華大基因公司合成），20 μL反應體系（5×First Strand synthesis Buffer，4 μL；dNTPmi 1uL；RNase Inhibitor，40units；Reverse Transcriptase（M-MLV），1μL；Stem-loop RT Primer，1μL；Total RNA 500 ng；RNase-free ddH2O），反應條件：65 ℃加熱5 min，放入冰中2 min。然后放入PCR儀16 ℃熱激30 min，42℃ 60 min，85 ℃，5 min停止反轉錄。

（2）qRT-PCR檢測c-miRNA表達水平：miRNA定量引物（北京六合華大基因公司）。反應體系按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）說明書進行配置。使用Bio-Rad iCycler PCR System進行Real Time PCR反應，程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；60℃ 30 s，40cycle。以上循環(huán)結束后進行65～95 ℃的融解曲線分析。每個樣品平行3次，溶解曲線為單一峰。按照2-ΔΔCt計算樣品的相對表達豐度。

1.5 c-miRNA差異表達譜的獲得及其與有氧耐力指標的相關性

1）計算訓練前后R-VO2max變化率η（R-VO2max）并采用K-means法進行聚類分析，根據(jù)聚類分析結果將學員分為對有氧訓練的高敏感表型組（High Response genotype Group，簡稱HR組）和普通敏感表型組（Common Response genotype Group，簡稱CR組）。比較兩組c-miRNA表達水平，參照Davidsen標準[10]提取HR組c-miRNA差異表達譜。

2）計算HR組差異表達的c-miRNAs在基線值-0 h階段（以下簡稱為階段Ⅰ）和0～24 h階段（以下簡稱為階段Ⅱ）的表達量變化率η（c-miRNA）：

η（c-miRNA）=[（階段終點表達量-階段起點表達量）/階段起點表達量]×100%

3）計算η（c-miRNA）與η（R-VO2max）和η（ILT）之間的Pearson相關系數(shù)，分析其相關性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件對結果進行處理。各項指標數(shù)據(jù)均采用（±s）表示。有氧耐力訓練前后各項指標的變化率η（Χ）=[（訓練值-基礎值）/基礎值]×100%。均數(shù)間比較采用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05表示兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。聚類分析采用k-means法。采用Bivariate過程進行兩組數(shù)據(jù)之間的相關性分析，計算Pearson相關系數(shù)并用r表示。

2 研究結果及分析

2.1 訓練前后R-VO2max與ILT變化率及其相關性

3 討論

本研究探討了運動適應性c-miRNA表達譜與有氧耐力的可訓練性之間的關聯(lián)，結果發(fā)現(xiàn)：η（R-VO2max）顯著高于普通水平的表型個體有17個c-miRNA差異表達，其功能主要富集于低氧適應通路和脂肪酸β氧化代謝途徑，調控毛細血管增生、血紅素生成、糖酵解相關酶功能、線粒體脂肪酸β氧化功能及骨骼肌重塑等適應性生理反應的關鍵基因表達，影響機體對訓練應激的適應性。其作用特點為協(xié)同性調控多系統(tǒng)對耐力訓練的應激適應。本研究結果提示：運動能力及其可訓練性與miRNA調控基因選擇性表達的模式有關。運動應激誘導的特征性c-miRNA表達譜與杰出運動能力表型存在關聯(lián)，可以用來預測運動能力的發(fā)展?jié)摿?，將具有相關運動天賦的運動員早期選拔出來加以系統(tǒng)培養(yǎng)，或用以評估運動員的訓練適應狀態(tài)/競技狀態(tài)，制訂個性化訓練方案。

遺傳選材的一個主要問題是如何評估個體的運動能力可訓練性，預測其運動能力發(fā)展?jié)摿15]。杰出運動能力是遺傳優(yōu)勢和營養(yǎng)、訓練等環(huán)境因素共同作用下的積累效應。機體對訓練應激的適應能力有條件地影響遺傳優(yōu)勢的表型化程度，決定了運動能力的可訓練性。應激誘導miRNA表達，調控基因表達強度，產生適應性的個體差異[17]。比較分析不同可訓練性群體的適應性miRNA表達譜差異，不僅可以建立高可訓練性群體的c-miRNA表達特征關聯(lián)模型，還提供了訓練應激與機體相互作用影響運動能力的有價值的信息。

最大攝氧量是評價有氧耐力的主要指標。個體VO2max主要受遺傳影響，耐力訓練可以在一定程度上改變VO2max水平，相同訓練條件下VO2max變化率反映了心肺有氧機能可訓練性的個體差異[18]。本研究采用VO2max變化率作為區(qū)別有氧能力可訓練性的指標分析運動應激誘導的c-miRNA表達差異，采用Targetscan、miRanda和mirBASE聯(lián)合分析差異表達的miRNA的靶基因，并進行GO分析和KEGG pathway分析，結合靶基因主要生理機能和代謝通路的共性特征研究HR組c-miRNA表達譜的調控特征。結果顯示：差異表達的17條miRNA的靶基因主要富集于低氧適應通路和PPAR信號通路，HR組miRNA表達模式促進相關代謝通路的應激適應能力，并顯示出多靶整合效應特征。

低氧應激激活HIF信號通路適應是獲得有氧耐力訓練效果的重要途徑[19]。常氧分壓條件下，有氧耐力訓練引起的低氧應激主要發(fā)生在心肌/骨骼肌等組織內[20]。有氧工作引起耗氧量增加，組織內氧分壓顯著降低，抑制HIF-1a降解，上調HIF-1a活性，調控下游EPO、VEGF等低氧適應基因表達水平上調，產生心肌和骨骼肌肌纖維毛細血管密度增加、Mb及血紅蛋白水平提高等適應效應，改善心肌和骨骼肌供血供氧，提高心臟和骨骼肌有氧工作能力。

運動應激誘導PPARδ和PPARα基因表達上調促進心肌骨骼肌脂肪酸β氧化對有氧運動能力具有重要作用。線粒體脂肪酸β氧化供能是心肌有氧代謝的主要供能方式，占心肌耗能的70%以上，對于維持心泵功能具有重要作用[21]。PPARδ調節(jié)PPARα促進心肌細胞脂肪酸β氧化，提高心泵功能[22]。進行有氧耐力訓練或在骨骼肌細胞過表達PPARδ都可以使PPARδ蛋白含量增加并獲得相似的表型改變和骨骼肌重塑：慢肌纖維收縮蛋白基因和脂肪酸β氧化相關基因表達上調，氧化型肌纖維增多，氧代謝效率提高，有氧耐力水平提高。阻斷PPARδ的作用，則不會產生上述改變[23]。

HR組差異表達的miRNA的功能主要是調控HIF-1a信號通路和PPAR信號通路對有氧訓練應激的敏感性和響應強度，其綜合適應效應與其運動適應表型特征是一致的。上調HIF-1a信號通路對低氧應激的敏感性可以使循環(huán)系統(tǒng)攜氧能力和心肌/骨骼肌的供氧水平提高更顯著。PPARδ和PPARα對運動應激誘導作用的反應性更好，可以更顯著上調心肌/骨骼肌脂肪酸β氧化代謝能力，心肌/骨骼肌有氧工作能力提高更明顯。心泵功能增強提高心輸出量，骨骼肌有氧代謝效率提高，可以增加提高動靜脈氧分壓差。VO2max水平取決于心輸出量和動靜脈氧分壓差[12]，因此上調HIF-1a信號通路和PPAR信號通路都可以使VO2max的可訓練性更好。同時，骨骼肌氧化型肌纖維增多，脂代謝供能比例增加還可以提高ILT水平[24]，這與HR組具有較高的η（ILT）是一致的。

HR組miRNA差異表達譜特征顯示出對多個應激適應通路的整合作用。差異表達的17條miRNA中，除miR210、miR423-5p和miR126專性調控低氧應激適應外，其余14條miRNA均同時作用于低氧應激適應通路和PPAR信號通路，在調控特點上顯示出整合效應。本研究結果顯示VO2max與ILT具有高度相關性，一方面證明了骨骼肌有氧代謝能力提高對VO2max的可訓練性具有重要的影響[18]，同時也提示我們miRNA對多種應激適應途徑的整合作用可能是有氧耐力的心肺機能和骨骼肌代謝的協(xié)調一致的重要調節(jié)機制。

分階段分析η（c-miRNA）與η（R-VO2max）和η（ILT）相關性結果表明：運動應激誘導的脂肪酸β氧化供能能力的提高對有氧耐力的可訓練性十分重要。在階段Ⅰ，η（miR183）與η（R-VO2max）和η（ILT）均呈顯著負相關，miR183[25]負性調節(jié)HIF-3a[20]和CROT[23]基因表達，促進HIF-1a的功能，同時抑制線粒體脂肪酸β氧化，研究表明：低氧應激提高糖酵解供能水平，抑制脂肪酸β氧化[19]。該結果提示：訓練過程中低氧應激對脂肪酸β氧化代謝功能的抑制作用不利于有氧耐力可訓練性的提高。在階段Ⅱ，η（miR141）和η（miR15a）均與η（R-VO2max）和η（ILT）正相關。研究表明：低氧應激誘導的HIF-2a[19]的高表達在應激結束后仍持續(xù)抑制PPARa和CPT1的表達和功能，損害線粒體脂肪酸β氧化能力[23]，miR141[26]和miR15a[27]均可上調PPARa的表達，PPARa又上調CPT1的表達，該結果提示：抑制低氧應激對脂肪酸β氧化能力的損害有助于提高VO2max和ILT的可訓練性。

此外，本研究結果還提示：機體抗損傷能力對于有氧耐力可訓練性也有重要的影響。在階段Ⅰ，η（R-VO2max）和η（c-miR133）呈負相關關系。miR133是肌肉特異性microRNA，運動過程中肌肉損傷漏出是其血漿水平升高主要原因[28]，該結果提示：骨骼肌抗運動損傷能力越強，訓練效果越好。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：在典型有氧訓練周期的運動性適應過程中，17條c-miRNAs的表達特征與有氧耐力的可訓練性之間存在密切的聯(lián)系并初步建立了關聯(lián)模型，同時也提出了一種采用表觀遺傳學指標進行運動員選材和指導訓練的方法，以c-miRNAs表達特征作為生物標記評估運動能力的發(fā)展?jié)摿陀柧氝m應狀態(tài)。進一步的研究將對c-miRNAs特征表達譜在運動員選材、訓練效果/競技狀態(tài)評估等方面的應用價值做出更為全面和深入的探索。

注釋：

① 該公式是根據(jù)同一受試者的R-VO2max直接測量值與12 min跑距離數(shù)值之間配對歸納得出的數(shù)值推算公式，反映的是R-VO2max與12 min跑距離之間的數(shù)值換算關系，如果采用公制單位該公式可以寫成

R-VO2max（mL/（kg·min））=（s/1 609.34-0.318）/0.027 8

由于原始文獻和相關文獻中引用該公式時12 min跑距離數(shù)值均采用英制，所以本研究也采用相同的表述方式。該公式是數(shù)值推算公式，僅表示R-VO2max與12 min跑距離之間的數(shù)值換算關系，不能從公式中得出單位。

② “OD260/280值”是提取核酸后檢驗其純度和完整性的指標，利用紫外分光光度計在260 nm和280 nm處的光密度比值判斷核酸提取物的純度和完整性，一般以OD260/280值在1.9～2.0范圍內表示提取物的純度和完整性較好，過高說明雜蛋白含量較高，過低說明RNA降解明顯。

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