滕 楊,谷 娜,羅時旋,李建慧,鄭曉鳳,侯麗然,侯 巍,高金波,*

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154007)

山藥硒多糖對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用

滕 楊1,谷 娜2,羅時旋2,李建慧2,鄭曉鳳2,侯麗然2,侯 巍1,高金波1,*

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154007)

目的:探究山藥硒多糖對CCl4導(dǎo)致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法:采用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型,測定山藥硒多糖對小鼠血清中 ALT、AST、ALP、ALB、γ-GT、TP,組織勻漿中 MDA、GSH水平的影響,并結(jié)合病理學(xué)HE染色,研究其對小鼠急性肝損傷的保護作用。結(jié)果:山藥硒多糖高劑量組與模型組相比可顯著地降低血清中的ALT、AST、ALB和ALP(p<0.01)以及肝組織中的MDA和GSH(p<0.05)含量,與對照組相比無顯著差異,中劑量治療組血清和肝組織中各種指標(biāo)與模型組相比有極顯著差異(p<0.01),與對照組相比有顯著性差異(p<0.05),中、高劑量治療組均可不同程度地改善CCl4所致的病理組織損傷,且顯著優(yōu)于低劑量組與山藥多糖治療組。結(jié)論:山藥硒多糖對CCl4所致的小鼠急性肝損傷具有保護作用,且隨濃度增高保護作用加強。

山藥硒多糖,四氯化碳,肝損傷,保護作用

山藥學(xué)名薯蕷(Dioscoreaopposita),為薯科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)植物山藥的塊莖,即可食用又可藥用,如《救荒本草》和《植物名實圖考》中所記載[1],藥用分布較北,而南方諸省則以食用為主,國家衛(wèi)生部已將山藥列入了第一批藥食兼用資源目錄[2]。粘液質(zhì)是山藥的主要活性成分之一,其中多糖含量約2.15%～2.96%[3]。硒是人體必需的微量元素,硒多糖作為一種有機硒化合物,兼有硒與多糖二者的活性,具有抗腫瘤[4-6]、抗氧化[7-9]、免疫調(diào)節(jié)[10-11]、降血糖[12-14]、降血脂等多種生理功能,是一種較好的生物補硒劑。本文在對山藥多糖進行硒化的基礎(chǔ)上,通過對CCl4引起的小鼠急性肝損傷動物模型血清特異指標(biāo)檢測和肝組織切片HE染色,考察山藥硒多糖的保肝作用,為山藥的進一步開發(fā)利用提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明種雄性小鼠70只 哈爾濱醫(yī)科大學(xué);聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司;四氯化碳 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)試劑盒 均購自和光純藥工業(yè)株式會社;還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、亞硒酸鈉、考馬斯亮藍G-250 南京建成生物工程研究所;牛血清蛋白A-9647 Sigma;山藥多糖(≥98%)本實驗室提取并純化;其他試劑均為分析純。

AU2700全自動生化分析儀(1600T/h) 日本OLYMPUS公司生產(chǎn);FA2004型分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;LG10-2.4A型高速離心機 北京京立離心機有限公司;紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠;B×41 光學(xué)顯微鏡 OLYMPUS;F6/10型手動勻漿機 上海凈信科技;DIR-CHEM5500自動生化分析儀 日本富士公司。

表1 小鼠血清中各種酶及蛋白含量測定結(jié)果

注:
注:Δ:p<0.01,與模型組比較,*:p<0.05,與模型組比較;⊙:p<0.01,與對照組比較,◎:p<0.05,與對照組比較,表2同。

1.2 實驗方法

1.2.2 動物分組與給藥 昆明種雄性小鼠(SPF級)70 只,隨機分成7 組(對照組,模型組,陽性組,山藥多糖組,山藥硒多糖高、中、低劑量組),每組10只,正常飼養(yǎng)一周后,對照組和模型組灌胃等量生理鹽水,陽性組灌聯(lián)苯雙脂2 g·kg-1,山藥多糖組灌胃給藥山藥多糖2 g·kg-1,高、中、低劑量組分別灌山藥硒多糖4,2,1 g·kg-1,連續(xù)灌胃給藥7 d;第7 d 給藥1 h后,除對照組外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液10 mL·kg-1;繼續(xù)同上喂養(yǎng)7 d,末次給藥1 h后,除對照組以外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液10 mL·kg-1。

1.2.3 肝損傷指標(biāo)的檢測 參考文獻[16]末次給藥24 h后,眼球取血,3000 r·min-1離心15 min;分離血清測定ALT、AST、ALP、γ-GT、ALB、TP含量;取小鼠肝臟稱重;然后取相同部位肝組織0.2 g用生理鹽水漂洗,配置成10%的組織勻漿液,勻漿,離心,取上清液。按試劑盒說明的方法測定肝組織中GSH、MDA的含量。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察 取肝大葉用10%的甲醛固定,按常規(guī)方法制備切片,進行HE染色,在光鏡下進行病理學(xué)檢查。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件包進行統(tǒng)計分析,多組計量資料分析采用One way ANOVA,多重比較采用LSD,當(dāng)p<0.01有極顯著差異,p<0.05有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥硒多糖的得率與硒含量

按實驗1.2.1方法合成10批山藥硒多糖,硒多糖的平均得率為36.81%±1.17%,含硒量為 3.42 mg·g-1。

2.2 鼠肝臟指數(shù)

肝臟指數(shù)是反映肝組織腫脹和炎性浸潤的指標(biāo),從表1可知,模型組肝臟指數(shù)極顯著高于正常對照組(p<0.01),說明CCl4導(dǎo)致肝組織腫脹和炎性浸潤。不同濃度的山藥硒多糖處理組肝臟指數(shù)逐漸下降,中、高劑量組較于模型組下降極顯著(p<0.01),且與對照組無顯著差異(p>0.05),低劑量組、山藥多糖組與模型組無極顯著差異(p>0.05),與對照組有顯著性差異(p<0.01),故山藥硒多糖的治療效果隨著濃度的增加有顯著的提高且優(yōu)于山藥多糖組。

2.3 血清中各種酶及蛋白含量的測定結(jié)果

由表1可知,模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT水平較對照組明顯升高,TP、ALB明顯降低,均有極顯著性差異;說明造模成功。山藥硒多糖高、中劑量組血清ALT、AST、ALP、γ-GT,水平較模型組明顯降低(p<0.01),ALB水平明顯升高(p<0.01),有極顯著差異。表示山藥硒多糖對CCl4導(dǎo)致的肝損傷有明顯的保護作用,而低劑量組與山藥多糖組和模型組相比,無顯著差異,與對照組有極顯著差異(p<0.01)?？赡苁且驗镃Cl4進入肝細胞后通過P450酶代謝激活,造成細胞膜的脂質(zhì)破壞和蛋白變性,肝細胞受損,轉(zhuǎn)氨酶便會釋放到血液里,使模型組酶含量升高,血清蛋白含量降低。給予山藥硒多糖干預(yù)后,由于硒可引起機體的過氧化物酶活力降低[17],有效發(fā)揮了硒多糖抗氧化活性,使各治療組血清中酶和蛋白含量均有改善,且治療效果隨給予劑量的增加而提高。

2.4 對肝組織中GSH、MDA的含量測定結(jié)果

由表2可知,模型組與對照組比較,GSH、MDA含量顯著升高(p<0.01),表明有嚴重脂質(zhì)過氧化損傷。陽性組與模型組比較,GSH、MDA含量顯著降低(p<0.05,p<0.01),說明有很好的治療效果。山藥硒多糖中、低劑量治療組與對照組相比有顯著性差異(p<0.05),與模型組無差異;山藥硒多糖高劑量組與模型組相比可顯著降低肝組織中GSH、MDA水平(p<0.05),表明山藥硒多糖較高濃度對CCl4所導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有明顯的保護作用。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,其活力大小可以反映機體硒水平,各治療組給藥干預(yù)后,提高了機體硒含量,促進GSH-Px酶系催化GSH變?yōu)镚SSG,使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害,降低了組織當(dāng)中的MDA和GSH含量。

表2 小鼠肝組織中MDA和GSH含量

2.5 組織病理學(xué)考察

圖2顯示了山藥硒多糖對小鼠肝組織病理變化的影響。由圖可知,正常組觀察到清晰的細胞,結(jié)構(gòu)正常;模型組、山藥多糖組細胞病變嚴重,CCl4代謝產(chǎn)物抑制細胞膜及線粒體膜上鈣泵的活性,導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流,使肝細胞變性、壞死,細胞質(zhì)流出,陽性組未出現(xiàn)大面積壞死的細胞;山藥硒多糖低劑量組細胞結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂,多數(shù)細胞質(zhì)流出;中劑量組部分肝細胞出現(xiàn)輕度水腫和脂肪變性;高劑量組細胞結(jié)構(gòu)完整、間隙清晰,明顯改善由CCl4造成的肝損傷,且治療效果隨山藥洗多糖濃度增加而加強。

圖2 肝組織HE染色Fig.2 The results of liver tissue by HE

3 結(jié)論

本實驗中,模型組的ALT、AST和MDA、GSH明顯升高(p<0.01),表明本實驗中的CCl4所致急性肝損傷模型成功。山藥硒多糖高劑量組可以極顯著降低小鼠血清ALT、AST的升高情況(p<0.01),說明其可通過減輕肝細胞脂肪變性和炎性細胞浸潤達到抑制肝細胞病變、改善肝損傷的作用。另外,GSH可通過為谷胱甘肽過氧化酶提供還原劑抑制自由基生成以保護肝細胞,山藥硒多糖高劑量組能顯著降低GSH含量(p<0.05),說明山藥硒多糖保護肝損傷的作用機制很有可能與其可以清除自由基有關(guān);病理組織結(jié)果顯示,山藥硒多糖高劑量組可顯著改善已損傷的肝組織,修復(fù)肝細胞。這些結(jié)果表明,山藥硒多糖高濃度組有保護小鼠急性肝損傷的作用,其高劑量組的治療效果與聯(lián)苯雙酯接近。

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Protective effect on liver injury induced by CCl4in mice of Yam selenium polysaccharide

TENG Yang1，GU Na2，LUO Shi-xuan2，LI Jian-hui2,ZHENG Xiao-feng2,HOU Li-ran2,HOU Wei1,GAO Jin-bo1,*

(1.The Key Laboratory of Biological Drugs,Education the Departmenrt of HeiLongJiang Province,Jiamusi 154007,China;2.Jiamusi University,Heilongjiang,Jiamusi 154007,China)

Object:To investigate the protective effect on acute liver injury induced by CCl4in mice of yam selenium polysaccharide. Method:ALT、AST、ALP、γ-GT、ALB、TP levels in serum and GSH、MDA levels in liver tissues were examined. In addition,pathologic changes were examined by HE staining. Results:The ALT,AST,ALP,ALB in serum and MDA,GSH in liver tissue of the high dose group of Yam selenium polysaccharide were lower than the model group and compared with the control group there was no significant difference,and the figure showed that there was significant difference betwen middle dose and modle group,also between middle dose and control group. In the treatment group,middle and high dose could significantly improve the pathological tissue injury ginduced by CCl4,and better than the low dose and the Chinese yam polysaccharide treatment roup. Conclusion:Yam selenium polysaccharide had a protective effect on acute liver injury induced by CCl4and strengthened with the increase its concentration.

Yam selenium polysaccharide;CCl4；acute liver injury;protective effect

2014-10-23

滕楊(1982-),女,在讀博士,講師,主要從事中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾及靶向遞藥系統(tǒng)研究,E-mail:tengyang19820405@163.com。

*通訊作者:高金波(1960-),女,本科,教授，研究方向：生物藥體內(nèi)分析，E-mail:gaojinbo2011@163.com。

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(LZR2014-033)；佳木斯大學(xué)青年基金項目(Sq2014-030)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)15-0362-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.068