張維誼 袁萬軍 王 建 徐 鋒 沈麗萍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

PCR檢測上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌

張維誼 袁萬軍 王 建 徐 鋒 沈麗萍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

2014年10月至2015年10月,從上海市動物疫病預(yù)防控制中心門診、上海地區(qū)規(guī)?；i場、屠宰場等采集的回腸、糞便及肛門拭子共254份樣本,結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理剖檢進(jìn)行初步鑒定,并通過建立的豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌多重PCR方法進(jìn)行鑒定。檢測結(jié)果顯示:豬痢疾短螺旋體陽性7份,大腸毛狀短螺旋體陽性為0,胞內(nèi)勞森菌陽性33份;陽性率分別為2.75%,0,13.0%。結(jié)果表明目前上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌均存在不同程度的感染和流行,這兩種病原均可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,應(yīng)當(dāng)引起足夠重視,檢測結(jié)果可在制定本地區(qū)豬腹瀉病的防控策略中作為參考。通過胞內(nèi)勞森菌套式PCR方法檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有36份陽性,陽性率為14.2%。

豬痢疾短螺旋體;大腸毛狀短螺旋體;胞內(nèi)勞森菌; PCR;檢測

豬腸道疾病綜合征一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大難題，為做到有的放矢的預(yù)防和治療，進(jìn)行正確的診斷是關(guān)鍵前提。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在引起腸道疾病的傳染性病原中豬腸道螺旋體和胞內(nèi)勞森菌是關(guān)鍵性病原，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。胞內(nèi)勞森菌是回腸炎（PE）的病原，豬痢疾短螺旋體可導(dǎo)致豬痢疾（SD），大腸毛狀短螺旋體是引起結(jié)腸螺旋體病的病原[1-2]。

胞內(nèi)勞森菌不能用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種螺旋體培養(yǎng)條件也比較苛刻，都很難培養(yǎng)并正確鑒別。然而控制這三種不同疾病的傳播首要的是做出正確的診斷，繼而采取相應(yīng)的防控措施。之前，在瑞典野豬群中曾檢測到過這三種病原[3]。多重PCR方法的應(yīng)用為快速診斷三種關(guān)鍵性腸道疾病起到了重要作用

了解B.hyo、B.pilo、LI在上海地區(qū)的流行狀況及其特點(diǎn)對豬腸道疾病的有效預(yù)防和控制將具有重要價(jià)值，同時(shí)對上海地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展也有一定促進(jìn)作用。本試驗(yàn)從臨床門診、規(guī)?；i場、屠宰場等地采集腸道、糞便及肛拭子樣本分別進(jìn)行多重PCR檢測和套式PCR檢測，以獲得上海地區(qū)B.hyo、B.pilo、LI流行狀況的數(shù)據(jù)，并為制定合理的防控措施提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及檢測樣本

胞內(nèi)勞森菌B3903株（購自Boehringer Ingelheim），豬痢疾短螺旋體（B78）、大腸毛狀短螺旋體（P43/6/78）由德國吉森大學(xué)Werner Herbst 博士惠贈。

自2014年10月至2015年10月共從上海市動物疫病預(yù)防控制中心門診（散養(yǎng)戶豬場）腹瀉病例中檢測樣本59份，屠宰場樣品125份，上海地區(qū)規(guī)?；i場樣本70份，共計(jì)254份。其中腸組織樣本220份，糞便樣本24份，肛拭子10份。

1.1.2 主要試劑

血液、組織DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒（均購自QIAGEN公司），PCR premix 2×（Takara），DNA Marker（TIANGEN），TAE緩沖液（上海雙螺旋），溴化乙錠（Ethidium bromide，EB），DEPC水，無水乙醇等。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），微量移液器，超凈工作臺（LABCONCO），普通PCR儀（Bio Rad），電子天平（METTLER），恒溫水浴鍋，凝膠成像系統(tǒng)（CHEMI GENIUS），核酸電泳儀（購自天能生物公司）等。

1.1.4 引物

參考Genebank序列，分別設(shè)計(jì)針對LI、B.hyo、B.pilo的多重引物[4]（見表1），送上海invitrogen公司合成。所合成的引物均先用DEPC水稀釋成濃度20pmol/μl后在用于PCR反應(yīng)。

1.2 方法

1.2.1 樣本核酸的提取

腸道粘膜組織DNA的提取和糞便及肛門拭子DNA的提取分別按QIAGEN血液、組織DNA提取試劑盒和QIAGEN糞便DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 胞內(nèi)勞森菌、豬痢疾短螺旋體和大腸毛狀短螺旋體多重PCR方法

25μl反應(yīng)體系：PCR premix 2× 12.5μl，L1/L2、H1/H2、P1/P2 各1μl，DEPC水 3.5μl，DNA模板 3μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 90s，68℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；68℃10min。PCR產(chǎn)物以1%凝膠電泳，并用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 多重PCR方法應(yīng)用

對采集的254份樣本核酸進(jìn)行多重PCR檢測，并將檢測結(jié)果分類匯總。

表1 多重PCR及套式PCR引物

2 結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 PCR電泳結(jié)果

電泳后結(jié)果如圖1。

圖1 多重PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 檢測結(jié)果

根據(jù)多重PCR方法對采集的樣本進(jìn)行檢測，共計(jì)檢出胞內(nèi)勞森菌陽性樣本36份，豬痢疾短螺旋體陽性樣本7份，大腸毛狀短螺旋體陽性樣本0份（表2），陽性率分別為14.2%，2.75%，0。在所有樣本中僅一份樣本中同時(shí)檢測到胞內(nèi)勞森菌和豬痢疾短螺旋體陽性，存在混合感染情況，其他均為單一感染。在檢測的三種病原中胞內(nèi)勞森菌檢出率最高，為14.2%；豬痢疾短螺旋體次之，為2.75%；大腸毛狀短螺旋體檢出率為0。對豬痢疾短螺旋體的檢測中，健康豬群中檢出率差別不大，均在5%左右，在屠宰場樣品中未檢測到；大腸毛狀短螺旋體在健康豬群和發(fā)病豬群中均未檢測到。

不同日齡的豬陽性率也不一樣，3～5周、6～8周、9～12周，大于13周的陽性率分別為15.4%、21.1%、34.1%、4.61%、14.2%，陽性率從最低的是13周齡后的豬，陽性率為4.61%，陽性率最高的是9-12周的豬，陽性率為34.1%，具體數(shù)據(jù)見表3。

表2 多重PCR檢測結(jié)果匯總

表3 不同日齡豬檢測結(jié)果

3 討論

（1）2014年冬至2015年春全國各地豬群中發(fā)生了較嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，應(yīng)用各種抗生素防治無效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。其病因比較復(fù)雜，目前國內(nèi)外對豬腹瀉病的研究比較集中3～5周齡以下豬群的病毒性及細(xì)菌性疾病，如傳染性胃腸炎、病毒性腹瀉、輪狀病毒、大腸桿菌、沙門氏菌等。豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌是引起3～5周齡以上（8～20周齡）豬群腹瀉病的關(guān)鍵的細(xì)菌性病原，國內(nèi)對于這三種關(guān)鍵性病原在豬群中的感染情況及流行趨勢鮮有報(bào)道。針對上述情況，我們從2014年10月至2015年10月對上海地區(qū)豬群中的這三種病原的流行情況進(jìn)行調(diào)查，以期獲得上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌感染情況的相關(guān)數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)臨床防控提供參考信息。

（2）三種病原分離培養(yǎng)都有一定難度，豬痢疾短螺旋體和大腸毛狀短螺旋體為嚴(yán)格厭氧；胞內(nèi)勞森菌微需氧，嚴(yán)格胞內(nèi)寄生，只能在特定細(xì)胞上培養(yǎng)。利用分離培養(yǎng)方法對這三種病原進(jìn)行鑒定周期長，效率低，成功率也低。目前比較常用的檢測方法是PCR和ELISA，有研究表明，PCR方法最為敏感。

（3）本實(shí)驗(yàn)所采用的多重PCR方法能同時(shí)檢測豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內(nèi)勞森菌三種病原，可應(yīng)用于豬腸道疾病的快速診斷。該方法做到了普通PCR需要做3次才能完成的檢測項(xiàng)目，不僅節(jié)省了大量的檢測時(shí)間和費(fèi)用，而且具有一定的特異性和敏感性，適應(yīng)于臨床腹瀉病流行病學(xué)的調(diào)查研究。

（4）多重PCR檢測結(jié)果顯示，在采集的254份糞便、回腸和肛門拭子中共檢測到7份豬痢疾短螺旋體陽性（陽性率為2.75%），33份胞內(nèi)勞森菌陽性（陽性率為13.0%），大腸毛狀短螺旋體陽性數(shù)為0。豬痢疾短螺旋體在門診和規(guī)?；i場的豬群中檢出率均在5～6%之間，在屠宰場樣本中檢出率為0，表明上海地區(qū)發(fā)病豬群中存在較低程度的感染，在健康豬群中基本沒有。檢測到的數(shù)據(jù)顯示大腸毛狀短螺旋體陽性率為0，但這并不代表上海地區(qū)不存在該菌感染，也應(yīng)加強(qiáng)防范，預(yù)防為主。胞內(nèi)勞森菌在散養(yǎng)戶豬場病例中檢出率最高，為28.8%，規(guī)?；i場中檢出率也有14.3%。表明上海地區(qū)豬群中普遍存在胞內(nèi)勞森菌感染，但規(guī)模化豬場帶菌率明顯低于散養(yǎng)戶豬場，這說明規(guī)范化的管理對于防治該病有一定積極意義。從屠宰場采集的外表健康的豬回腸中也檢測到6例帶菌豬，陽性率4.8%，表明部分屠宰豬感染胞內(nèi)勞森菌后呈現(xiàn)隱性感染，這可能與抗生素的使用有關(guān)。由于當(dāng)前國內(nèi)抗生素使用非常普遍，在抗生素作用下未表現(xiàn)出明顯的腹瀉癥狀，也因此容易被人們所忽略。

（5）有報(bào)道顯示，豬群中胞內(nèi)勞森菌血清學(xué)轉(zhuǎn)化常發(fā)生在8～10周齡[5]，這與母源抗體的保護(hù)性有關(guān)，在此階段失去母源抗體保護(hù)后可能增加其感染胞內(nèi)勞森菌的風(fēng)險(xiǎn)。本研究與國外報(bào)道的胞內(nèi)勞森菌感染年齡階段基本吻合，結(jié)果顯示9～12周齡豬感染率最高（34.1%），6～8周齡次之（21.1%），育成豬最低。

[1] 翁善鋼.豬痢疾短螺旋體病的診斷與防控[J].養(yǎng)豬，2015，（3）：92-95.

[2] 寇亞輝.豬痢疾短螺旋體的分離、鑒定與血清抗體ELISA檢測方法的建立[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

張維誼（1979—），女，碩士，高級獸醫(yī)師，一直從事動物疫病的檢測，監(jiān)測、診斷、流行病學(xué)調(diào)查和相關(guān)科學(xué)的研究、技術(shù)推廣。