顏秋霞漆正宇趙曉英郭曉燕陳彩蓉蔡志明唐愛發(fā)**. 廣東省清遠市人民醫(yī)院暨暨南大學附屬清遠人民醫(yī)院生殖中心（清遠 558）;. 北京大學深圳醫(yī)院廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室;. 深圳市第二人民醫(yī)院暨深圳大學第一附屬醫(yī)院科教科

ACRV1在正常男性和弱精子癥患者精液精子中的表達差異*

顏秋霞1漆正宇2趙曉英1郭曉燕1陳彩蓉1蔡志明3唐愛發(fā)3**
1. 廣東省清遠市人民醫(yī)院暨暨南大學附屬清遠人民醫(yī)院生殖中心（清遠 511518）;
2. 北京大學深圳醫(yī)院廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室;
3. 深圳市第二人民醫(yī)院暨深圳大學第一附屬醫(yī)院科教科

摘要目的 研究精子頂體小泡蛋白-1（ACRV1）在正常人和弱精子癥患者精液精子中的表達差異，探討ACRV1在弱精子癥發(fā)生機制中的作用。方法 采用計算機輔助精液分析（CASA）技術(shù)對精液進行常規(guī)分析，經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心分離純化正常男性和弱精子癥患者精液精子，以排除生精細胞和白細胞的污染。采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）和免疫印跡（Western Blot）方法，從mRNA和蛋白水平檢測ACRV1的表達及其差異。結(jié)果 Real-time PCR結(jié)果表明，ACRV1 mRNA在弱精子癥患者精子中的表達量明顯低于其在正常對照組精子中的表達量，下降了5.9倍。Western Blot發(fā)現(xiàn)ACRV1蛋白在弱精子癥組較正常組下降，該結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相一致。結(jié)論 ACRV1基因及蛋白在弱精子癥患者精子中的表達下調(diào)可能與精子活力下降有密切關(guān)系，提示ACRV1基因及蛋白可能是導致弱精子癥發(fā)生的原因之一。

關(guān)鍵詞ACRV1; 聚合酶鏈反應; 印跡法, 蛋白質(zhì); 弱精子癥

在全世界范圍內(nèi)，不孕不育癥占育齡夫婦的15%左右，其中男性因素導致不孕不育的占50%[1, 2]。男性不育的重要原因之一就是精子活力低下所導致的弱精子癥，80%的男性不育與精子活動障礙有關(guān)，其中20%與精子活動力低下直接相關(guān)[3]。弱精子癥是男性不育的重要原因，表現(xiàn)為精子的運動能力低下，而精子頭部結(jié)構(gòu)的異常以及精子尾部軸絲和纖維鞘結(jié)構(gòu)的異常，都可能影響精子鞭毛的運動，導致精子運動能力下降,最終導致弱精子癥的發(fā)生[4]。在人和哺乳動物成熟精子中有2 000種以上不同基因的表達，它們在精子運動、精子獲能和頂體反應過程中具有重要的作用[5-7]。到目前為止，一些基因如Tektin-2[8]、DNAH11[9]、AKAP4[10]、SEPT4等[11]和一些蛋白如ANXA5[12]、PRM2[13]、CLUpre[14]、SABP等[15]被證實與弱精子癥的發(fā)生有關(guān)，但目前對弱精子癥的病因和發(fā)病機制，尤其是精子運動和精子活動力低下的分子機理仍不清楚，因此研究精子運動和弱精子癥的分子生物學機理成為一項迫切的任務。這將為探討弱精子癥發(fā)生的分子機制及尋找其治療途徑提供重要依據(jù)。

精子頂體小泡蛋白-1（Acrosomal vesicle protein 1，ACRV1）是一個精子頂體蛋白，在哺乳動物中高度保守，它在精、卵結(jié)合的頂體反應中扮演著重要角色[16-18]。我們的前期研究結(jié)果表明：ACRV1特異性地表達于小鼠和人的睪丸組織以及人睪丸組織的圓形和長形精子細胞中，這些結(jié)果提示，ACRV1可能在精子發(fā)生的過程中具有重要作用[19-21]。本研究擬采用Real-time PCR和Western Blot等技術(shù)，比較正常精子和弱精子癥患者精子中ACRV1的表達差異，揭示ACRV1與精子活力的關(guān)系，以期為不育癥的診斷、治療及預后判斷提供充分的分子生物學依據(jù)。

材料與方法

一、材料

RNAfast200 Kit購自上海飛捷；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒和 Taq DNA Polymerase PCR 試劑盒均購自Fermentas公司；SYBR Green qPCR master mix 購自OMEGA公司；鼠抗ACRV1一抗購自abvon公司；HRP-兔抗鼠IgG二抗購自santa公司。其他試劑均為分析純。

二、方法

（一）精液樣本收集

標本來源于廣東省清遠市人民醫(yī)院生殖中心的門診病人，按照第五版世界衛(wèi)生組織標準[22]，精液常規(guī)正常參考值：禁欲2～7d，精液量2～6mL，呈灰白色或淡黃色，pH 7.2～7.8，小于60min全部液化，精子濃度≥15 ×106/mL，精子活力：前向運動精子（PR）≥32%且PR+非前向運動精子（NP）≥40%。精子形態(tài)學檢查方法：采用Diff-Quik快速染色法，油鏡下觀察精子形態(tài)，以正常精子形態(tài)≥4%為形態(tài)學正常診斷標準。白細胞＜1×106/mL。弱精子癥患者的精液標本：禁欲2～7d，精液量2～6 mL，呈灰白色或淡黃色，pH 7.2～7.8，小于60min全部液化，精子密度≥15×106/mL、精子活力PR級＜32%或（PR+NP）級＜40%。排除精漿抗精子抗體陽性，精漿果糖、α-糖苷酶、精漿鋅和生殖激素等檢查均正常。所有精液樣本均排除感染、附睪或睪丸炎、系統(tǒng)性疾病史，且常規(guī)體格檢查正常。臨床標本收集經(jīng)過清遠市人民醫(yī)院倫理委員會通過，所有標本收集前均告知患者，并獲取患者知情同意。

（二）Percoll法分離精液

為避免圓形細胞的污染（生精細胞和白細胞），按文獻方法[5]，每次分別選取10份正常精液和10份弱精子癥精液，液化后的精液經(jīng)95%、76%、57%和47.5%的 Percoll非連續(xù)梯度離心 300×g，20min，收集正常組中95% Percoll以下的精子和弱精子癥組中57%與76% Percoll層之間的精子, 磷酸鹽緩沖液洗滌2次（600×g，5min），分離純化后的精子儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

（三）精子總RNA提取和cDNA合成

取1～2×107精子，按照RNAfast200 Kit（上海飛捷）提取RNA。RNA提取步驟如下：（1）處理好的精子沉淀中，加入RA2液500μL，充分顛倒混勻min；（2）將樣本裂解物吸入或倒入內(nèi)套管，離心1min；（3）棄去外套管中液體，內(nèi)套管中加入00 μL洗液，離心1min。再重復此過程洗一次；（4）取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，離心1min；（5）將內(nèi)套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入洗脫液30μL，室溫靜置1min，離心1min，獲得總RNA。紫外分光光度計定量后于-80℃儲存?zhèn)溆?。采用反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒（Fermentas公司，美國）進行逆轉(zhuǎn)錄。取等量的精子總RNA 500ng，加oligo(dT)18 primer（0.5 μg/μL）1μL，加DEPC處理的水至12μl，70℃加熱5 min后，加入5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，RNA酶抑制劑（20u/μL）4 μL，10 mmol/L dNTP 2μL，37℃孵育5min，最后加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/μL）1 μL 至20 μL，42℃60 min，72℃ 10 min 后，置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA作為模板用于實時熒光定量PCR。

（四）實時熒光定量PCR（Real-time PCR）

Real-timePCR引物由華大基因公司合成（見表1）。Real-timePCR反應體系為25μL，按照試劑盒（OMEGA）的要求在冰上進行以下組分的混合：cDNA（500ng/20μl）：1μL；引物（10pmol/L）：0.2μL，ROX Reference Dye：0.5μL；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG：12.5μL；DEPC-treated water：10.8μL。反應條件采用4步法：50℃2min，95℃ 2min（預變性）后進入45個循環(huán)：95℃變性15s；55℃退火30s；72℃延伸40s；延伸后60℃采集熒光；整個操作流程在ABI7000儀器上進行，每個樣本重復3次，每次所檢測的Ct值取其平均值。ACRV1 mRNA的表達采用△△Ct法進行相對定量分析?！鳌鰿t =實驗組目的基因△Ct值-對照組目的基因△Ct值。基因的表達差異為2-△△ct.。2-△△ct＞2為表達上調(diào)，2-△△ct＜0.5為表達下調(diào)，2＞2-△△ct＞0.5為表達無明顯變化。

表1 Real-time PCR引物序列

（五）免疫印跡實驗（Western Blot）

用RIPA試劑提取精子的總蛋白，超聲裂解20s×5，置于冰上30min，15 000×g離心15 min。用BCA法檢測蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白。半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜（20mA 20min），用含脫脂牛奶的TBST室溫孵育1h，一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2h，PBST漂洗3次，用免疫發(fā)光試劑盒發(fā)光，Dolphin分析軟件測定灰度值，每一樣本的灰度值與其相對應GAPDH灰度的比值作為該樣本蛋白的相對量，用于統(tǒng)計分析。

（六） 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用 t 檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、精液分析結(jié)果

對100例精液標本進行參數(shù)檢測，正常人和弱精子癥患者兩組之間的年齡、精子濃度均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；弱精子癥組的PR及PR+NP精子比例較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。兩組精液分析的主要參數(shù)結(jié)果見表2。

二、Real-time PCR PCR 結(jié)果

應用Real-time PCR技術(shù)檢測兩組精子細胞內(nèi)ACRV1 mRNA的表達水平。ACRV1 mRNA為目的基因，GAPDH作為內(nèi)參基因作數(shù)據(jù)的標準化處理，正常組和弱精子癥組的△Ct 值分別為4.60±1.21和7.14±0.93。與正常組精子比較，ACRV1 mRNA在弱精子癥患者精子中的表達顯著降低（P＜0.05）（2-△△ct對應值分別為1和0.17），降低達5.9倍（見表3）。GAPDH作為內(nèi)參在兩組之間的表達無顯著性差異?？紤]到睪丸生精細胞和白細胞對結(jié)果的影響，我們對C-kit（生精細胞標志物）和CD45（白細胞標志物）進行擴增，未能檢測到C-kit 和CD45在人精液精子中的表達，排除了圓形細胞污染的可能性。

表2 正常組和弱精子癥組精液分析的主要參數(shù)結(jié)果比較（x±sxs）

表3 正常對照組和弱精子癥組中ACRV1 mRRNNAA 表達量（xx±ss）

三、Western Blot lot 結(jié)果

正常對照組與弱精子癥精子總蛋白的Western Blot檢測結(jié)果如圖1所示，兩組樣本在相對分子質(zhì)量為29kD 處均檢測到ACRV1 的蛋白條帶，同時在相對分子質(zhì)量為36 kD均檢測到內(nèi)參蛋白GAPDH的表達，兩組樣本GAPDH表達量基本相同，從而證明上樣量基本一致，實驗結(jié)果是可信的。Dolphin軟件對各條帶的灰度值進行對比分析后發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，ACRV1蛋白在弱精子癥組中的表達顯著下降。

圖1 Western Blot 檢測AACCRRVV11蛋白在正常對照組和弱精子癥患者精子中的表達

討 論

按照第五版世界衛(wèi)生組織標準，弱精子癥是指精液中的PR＜32%或（PR+NP）＜40%的病癥。精子在女性生殖道內(nèi)的運行，除受女性生殖道收縮所給予的推動力外，主要依靠精子本身的主動運動，只有正常作前向運動的精子才能確保精子抵達輸卵管壺腹部，并與卵子結(jié)合形成受精卵。因此，精子活力低下會嚴重影響生殖過程中精卵相遇及卵子穿透率，進而增加不育概率。造成精子活力低下的原因有很多，如生殖道感染、免疫因素、精索靜脈曲張、精漿異常、內(nèi)分泌功能異常、精子本身的結(jié)構(gòu)異常、染色體異常等。引起弱精子癥的機制復雜，不僅涉及精子運動結(jié)構(gòu)和功能的異常，而且涉及與精子運動密切相關(guān)的能量代謝的缺陷，還涉及到信號傳導通路的異常等，但其發(fā)病機制尚不清楚。對弱精子癥的治療也一直是臨床醫(yī)生的一大難題，各種經(jīng)驗性、非特異性的治療方法被用來提高弱精子癥患者的精子參數(shù)和生育能力，但效果甚微。

ACRV1位于人染色體11q24.2，通過不同剪接產(chǎn)生4種變異剪接亞型，其中，最長的轉(zhuǎn)錄本占總mRNA的53%～72%，第二長的轉(zhuǎn)錄本占15%～32%，第三和第四長的分別占3.4%～8.3%和8.7%～12.5%，其余的轉(zhuǎn)錄本占＜1%。ACRV1特異性地表達于小鼠和人的睪丸組織以及人睪丸組織的圓形和長形精子細胞中[19-21]，同時ACRV1還是一個睪丸特異性的分化抗原，在受精過程中可能參與了精子和卵泡的結(jié)合或者精子穿膜等過程[17]。

精子活力是指精子前向運動的能力，精子頭部結(jié)構(gòu)的異常以及精子尾部軸絲和纖維鞘結(jié)構(gòu)的異常，都可能影響精子鞭毛的運動，導致精子運動能力下降，最終導致弱精子癥的發(fā)生。本文通過Real-time PCR 技術(shù)檢測ACRV1 mRNA 在正常人精子及弱精子癥患者精子中的表達，結(jié)果表明ACRV1 mRNA 在弱精子癥患者較正常人表達下調(diào)約5.9倍（P＜0.05）。但由于生物體內(nèi)mRNA 的表達與蛋白質(zhì)表達豐度往往是不一致的，而真正生物學功能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此我們采用Western Blot技術(shù)進一步在蛋白表達水平上對ACRV1 進行了檢測，實驗發(fā)現(xiàn)ACRV1 蛋白在弱精子癥患者及正常人精子中均有表達，且在弱精子癥患者中表達較正常人表達下降。實驗結(jié)果說明，ACRV1基因及蛋白表達水平的異常是影響患者精子活力的一個重要因素，ACRV1在男性生殖中可能起著十分重要的作用。

總之，ACRV1在弱精子癥患者精子中的表達下降，可能是導致精子活力低下的原因之一，但是尚需對ACRV1表達下調(diào)的機制、相互作用蛋白及其所處的細胞信號傳導通路做進一步的深入研究。

參 考 文 獻

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（2014-12-05收稿）

**通訊作者, E-mail: tangaifa2004@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.003

中圖分類號R 698.2e To compare the different expression of ACRV1 in ejaculated spermatozoa between normal fertile men and the patients with asthenospermia, and investigate its roles in the pathogenesis of asthenospermia. Methods Semen routine analysis were carried out using calculator assistance sperm analysis (CASA) technique. The sperms were separated and purifi ed from semen sample by Percoll discontinuous density gradients, and the relative expression of ACRV1

*基金項目資助: 廣東省清遠市科技計劃項目資助（項目編號：2012B011204127，2014B012; 廣東省醫(yī)學科研基金資助（B2014426）;國家自然科學基金資助（項目編號：81170613，81270740）; 深圳市科技計劃項目（JCYJ20140416180323426）;深圳市基礎(chǔ)研究計劃杰出青年項目（JC201005260216A）

Differential expression of ACRV1 in ejaculated spermatozoa from normal fertile men and patients with asthenospermia

Yan Qiuxia1, Qi Zhengyu2, Zhao Xiaoying1, Guo Xiaoyan1, Chen Cairong1, Cai Zhiming3, Tang Aifa3**
1. Center for Reproductive Medicine, The People's Hospital of Qingyuan, The Affiliated Qingyuan People's Hospital of College of Jinan University, Guangdong 511518, China;
2.Guangdong Key Lab of Male Reproductive Medicine and Genetics, Peking University Shenzhen Hospital;
3. Department of Science and Education of Shenzhen Second People's Hospital, The First Affi liated Hospital of Shenzhen University.
Corresponding author: Tang Aifa, E-mail: tangaifa2004@163.com

AbstractObjectivewas detected by real-time PCR and western blot respectively. Resultssults The expression of ACRV1 was down-regulated by 5.9 times in asthenospermia patients as compared with that in normal fertile men (P<0.05). The expression of ACRV1 protein in the patients with asthenospermia was signifi cantly lower than that in normal fertile men, which is consistent with the results from real-time PCR. Conclusionusion The lower expression of ACRV1 in ejaculated spermatozoa of the patients with asthenospermia might be a reason for low sperm motility.

Key wordsords ACRV1; polymerase chain reaction; blotting, western; asthenospermia