李開濟(jì)，郝曉方，章廣玲，魏靜波，魏 潔，林雅軍，甄永占*

(1.華北理工大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病重點實驗室 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室,河北 唐山 063000； 2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院 衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730)

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研究論文

重組人KNDC1腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其促HUVEC衰老作用

李開濟(jì)1，郝曉方1，章廣玲1，魏靜波1，魏 潔2，林雅軍2，甄永占1*

(1.華北理工大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病重點實驗室 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室,河北 唐山 063000； 2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院 衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730)

目的構(gòu)建人KNDC1腺病毒表達(dá)載體，觀察其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的表達(dá)及功能。方法擴(kuò)增KNDC1基因并與腺病毒骨架載體進(jìn)行體外重組連接，經(jīng)篩選、測序確認(rèn)后轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293A細(xì)胞進(jìn)行包裝；按pAdenoX試劑盒的步驟純化重組腺病毒，通過終點稀釋法測定病毒滴度；用pAdeno Ⅹ-KNDC1感染HUVEC，48 h后用Western blot檢測KNDC1蛋白表達(dá)水平；用SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老情況。結(jié)果經(jīng)測序確認(rèn)目的基因KNDC1成功克隆入腺病毒載體中。轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后觀察到細(xì)胞變圓、部分細(xì)胞漂浮的特征性病變效應(yīng)，病毒滴度達(dá)到1×1011PFU。感染了pAdeno Ⅹ-KNDC1的HUVEC中KNDC1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。隨著pAdeno Ⅹ-KNDC1劑量的增加，衰老HUVEC數(shù)量增多。結(jié)論人KNDC1腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功并能促進(jìn)HUVEC衰老。

KNDC1；腺病毒；同源重組；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

細(xì)胞衰老是生物體機(jī)能退行性改變的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老是內(nèi)皮失功能的常見原因，也是動脈粥樣硬化發(fā)生的病理生理機(jī)制之一。因此，研究與內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)的基因改變是探討血管衰老機(jī)制的基礎(chǔ)[1]。KNDC1(kinase non-catalytic C-lobe domain (KIND) containing 1, v-KIND)是2006年發(fā)現(xiàn)的基因，其存在于神經(jīng)元樹突、鳥苷酸交換因子復(fù)合物以及神經(jīng)元細(xì)胞體中。在許多信號傳導(dǎo)通路的蛋白間分子識別和功能調(diào)控中扮演著重要角色。但目前KNDC1域的結(jié)構(gòu)和功能特征仍未知[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)敲低KNDC1的表達(dá)能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老[3]。但是，如果使KNDC1過表達(dá)是否能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖呢？為回答這一問題，本研究構(gòu)建了攜帶KNDC1基因的腺病毒載體，通過轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞觀察細(xì)胞衰老情況。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HEK293A細(xì)胞(衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所陳北冬博士饋贈)用含10%胎牛血清(HyClone公司)、100 U青霉素、100 U鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)、在37 ℃、5% CO2孵箱(Thermo公司)傳代培養(yǎng)。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為本室從臍靜脈中分離，用含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基(HyClone)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。KNDC1真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-KNDC1(北京傲銳東源生物公司)。腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)Adeno-Ⅹ(Clontech公司)，其中包括感受態(tài)細(xì)胞(StellaTM Competent Cells，E.coliHST08 strain)及腺病毒骨架載體(pAdeno Ⅹ-CMV)。限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。BCA 試劑盒(北京索萊寶公司)?？筀NDC1、β-actin抗體(Santa Cruz公司)，兔抗山羊和山羊抗兔的二抗(Santa Cruz公司)。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-gal)(Sigma公司)。

1.2 獲取目的基因

以pCMV6-AC-GFP-KNDC1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得KNDC1，再用瓊脂糖膠回收法純化目的基因。獲得的目的基因KNDC1的兩側(cè)分別含有與pAdeno Ⅹ-CMV上重組位點兩端同源的15 bp堿基對。用于擴(kuò)增的上下游引物(Invitrogen公司合成)分別為：上游引物5′-GTAACTATAACGGTCATG CAGGCCATGGACC-3′；下游引物5′-ATTACCTCT TTCTCCGGAGCTCGCCGGCGCTA-3′，用于擴(kuò)增的聚合酶為PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer(TaKaRa公司)。

1.3克隆pAdeno Ⅹ-KNDC1

100 ng KNDC1(兩端分別連接了15 bp的同源臂)與200 ng pAdeno Ⅹ-CMV混合，加入In-Fusion?HD酶(Clontech公司)，50 ℃孵育15 min。取1.5 μL反應(yīng)液加入一管感受態(tài)菌(100 μL)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程：冰上孵育30 min，42 ℃熱激90 s，冰上孵育2 min后立即加入900 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h后取100 μL均勻涂布于含氨芐青霉素LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆(圖1)。

PCMV IE.cytomegalovirus immediate early promoter; SV40 polyA.simian virus 40 polyA signals; ITR.inverted terminal repeat; Amp: ampicillin圖1 KNDC1腺病毒同源重組示意圖Fig 1 Schematic diagram of homologous recomb-ination of pAdeno Ⅹ-KNDC1

1.4 pAdeno Ⅹ-KNDC1質(zhì)粒的鑒定

挑取的單個克隆取少量作為模板進(jìn)行菌落PCR，上游引物為5′-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATG TTGC-3′;下游引物為5′-TACCGTAGCTGAGCTTC TAG-3′。選取能擴(kuò)增出5.2 kb左右片段的的單個菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩生長至A600值為0.8，離心收集菌體，NucleoBond Xtra Midi(Macherey-Nagel公司)提取重組腺病毒質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖電泳分析后進(jìn)行測序(Invitrogen公司)。

1.5 人KNDC1腺病毒顆粒的產(chǎn)生

取10 μg pAdeno Ⅹ-KNDC1質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切，異丙醇沉淀、純化回收后，將0.8 μg線性化pAdeno Ⅹ-KNDC1質(zhì)粒和2 μL lipofectamine2000混合與100 μL無血清無雙抗MEM培養(yǎng)基(HyClone公司)混合，轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞。每天于倒置顯微鏡(Olympus CKX31)下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，簡單離心沉淀細(xì)胞碎片，取細(xì)胞裂解液上清感染正常HEK293A細(xì)胞獲取高滴度病毒。

1.6 終點稀釋法檢測病毒滴度

實驗前24 h，將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，保證每孔實驗時的細(xì)胞數(shù)約為5×103個；準(zhǔn)備10個無菌的離心管，在第一個離心管中加入990 μL的完全培養(yǎng)液，其余的9個管子中各加入900 μL的完全培養(yǎng)液。待測病毒液的稀釋：取10 μL腺病毒原液加入990 μL 的離心管中，做1∶100稀釋(10-2)；然后以此為起點，再取100 μL稀釋液加入到900 μL 的離心管中做1∶10稀釋(10-3)，直至稀釋到10-13。從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，在顯微鏡下確定每孔的細(xì)胞均生長良好。吸棄舊培養(yǎng)液，然后依次將10-13至10-6稀釋的病毒液加入96孔板中，每1稀釋度占用1行，每1行的第1～10每孔加入90 μL病毒稀釋液，而每1行的第11～12每孔均加入90 μL不含病毒的完全培養(yǎng)基作為對照。將96孔板置于置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，10 d后觀察細(xì)胞病變，并計算病毒滴度(Spearman-Karber method)，公式如下：病毒滴度=10(x+0.8) (PFU)，x=10-1到10-13依次稀釋度下細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)陽性率總和[4]。

項目片區(qū)選擇要充分考慮對生態(tài)環(huán)境的影響，嚴(yán)禁在水資源開發(fā)接近限值的地區(qū)規(guī)劃灌溉面積，水資源條件難以滿足或取水對生態(tài)環(huán)境有明顯影響的項目區(qū)要在論證階段及時調(diào)整。水資源論證要重點分析項目實施對濕地、湖泊和河流等生態(tài)環(huán)境敏感的地區(qū)和生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū)的影響，科學(xué)評價同一水文地質(zhì)單元內(nèi)長期取水后的累積影響和連續(xù)枯水年份地下水的保證程度和風(fēng)險分析，按照水功能區(qū)納污能力控制管理要求，合理分析項目退水可能引發(fā)的地表水體和地下水體污染以及面源污染威脅等，防止出現(xiàn)生態(tài)環(huán)境問題和生態(tài)災(zāi)難。

1.7 Western blot 分析

將HUVEC細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h后分別加入PBS、pAdeno Ⅹ-CMV，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。2 h后將轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜置于含8%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，室溫封閉2 h后加入含抗KNDC1或抗β-actin的一抗孵育液(1∶1 000)，4 ℃振蕩孵育過夜，TBST 洗3次，每次15 min，加入TBST 緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫振蕩1 h，TBST 洗3次，每次15 min。Millipore發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將PVDF膜在Alpha凝膠成像儀上照相并分析各條帶吸光度變化。

1.8 細(xì)胞衰老檢測

將HUVEC細(xì)胞接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h后分別加入PBS、30、60或90 MOI(multiplicity of infection)pAdeno Ⅹ-KNDC1處理48 h，然后按照衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進(jìn)行衰老檢測[5]。

2 結(jié)果

2.1 pAdeno Ⅹ-KNDC1的克隆

測序驗證確認(rèn)pAdeno Ⅹ-CMV的重組克隆位點已準(zhǔn)確連接了目的基因KNDC1的開放閱讀框(圖2)。

2.2 人KNDC1腺病毒顆粒的產(chǎn)生和感染效率

PAdeno Ⅹ-KNDC1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后第10天可觀察到特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，即細(xì)胞變圓,折光性增強(qiáng)，并開始出現(xiàn)明顯噬斑甚至細(xì)胞脫落，收集的細(xì)胞裂解液(初代腺病毒)感染HEK293A細(xì)胞48 h后，感染組細(xì)胞60%以上變圓飄起呈串珠狀，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率可達(dá)60%以上(圖3)。

由于稀釋度為10-10的孔中CPE均為陽性，所以認(rèn)為稀釋度為10-1至10-9的孔中CPE也都為陽性，則根據(jù)x=10-1到10-13依次稀釋度下CPE陽性率總和X=1×10+0.3=10.3。根據(jù)滴度計算公式，本樣品的滴度=10(x+0.8)=10(10.3+0.8)=1011=1×1011PFU(圖4)。

圖2 KNDC1基因測序圖譜Fig 2 KNDC1 gene sequencing map

A.light microscopy picture of control group; B.fluorescent microscopy picture of control group; C.light microscopy picture of pAdeno Ⅹ-KNDC1 treated group; D.fluorescent microscopy picture of pAdeno Ⅹ-KNDC1 treated group

圖3 初代腺病毒感染HEK293A細(xì)胞48 h
Fig 3 Primary pAdeno Ⅹ-KNDC1 was amplified in HEK293A (48 hours after HEK293A was infected)(×100)

A.light microscopy picture of 10-12dilution degrees; B.fluorescent microscopy picture of 10-12dilution degrees; C.light microscopy picture of 10-11dilution degrees; D.fluorescent microscopy picture of 10-11dilution degrees; E.light microscopy picture of 10-10dilution degrees; F.fluorescent microscopy picture of 10-10dilution degrees

圖4 KNDC1腺病毒載體滴度測定
Fig 4 The titer of pAdeno Ⅹ-KNDC1(×100)

2.4 KNDC1蛋白在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot檢測到相對分子質(zhì)量56 ku特征條帶，其大小與KNDC1蛋白基本吻合，且其含量較PBS 和pAdeno Ⅹ-CMV 處理的HUVEC細(xì)胞明顯增高(圖5)。

A.the expression of KNDC1 in HUVEC of control group; B.the expression of KNDC1 in HUVEC of pAdeno Ⅹ-CMV treated group; C.the expression of KNDC1 in HUVEC of pAdeno Ⅹ-KNDC1 treated group圖5 KNDC1在HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)Fig 5 The expression of KNDC1 in HUVEC

2.5 Ad-KNDC1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老

隨著pAdeno Ⅹ-KNDC1濃度的增加，衰老細(xì)胞數(shù)量顯著增多。對照組、30、60和90 MOI pAdeno Ⅹ-KNDC1處理衰老細(xì)胞百分比分別為0%、10%、30%和60%。

A.control group; B.30 MOI treated group; C.60 MOI treated group; D.90 MOI treated group圖6 pAdeno Ⅹ-KNDC1誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞衰老Fig 6 Cell senescence of HUVEC was induced bypAdeno Ⅹ-KNDC1(×100)

3 討論

過氧化氫(H2O2)、氧化型LDL或TNF-α等促動脈粥樣硬化和促炎性反應(yīng)因子能夠通過Akt依賴的機(jī)制誘發(fā)端粒失活，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞早衰[6- 7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老是動脈粥樣硬化和其他年齡相關(guān)心血管疾病的基礎(chǔ)。KNDC1是2006年發(fā)現(xiàn)的基因，其功能與Ras鳥苷酸交換因子活性和蛋白絲/蘇氨酸激酶活性相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)KNDC1 siRNA處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[3]。本研究利用腺病毒載體構(gòu)建重組人KNDC1腺病毒顆粒，使其可以在原代細(xì)胞中高表達(dá)KNDC1蛋白，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

腺病毒載體的構(gòu)建方法大致可分為體外連接法、同源重組法及位置特異性重組，其中在原核細(xì)胞中進(jìn)行同源重組的方法應(yīng)用比較廣泛[8]。本研究選用的腺病毒載體為人腺病毒Ⅹ型。首先將KNDC1基因片段插入到pAdeno Ⅹ-CMV載體中，通過同源重組的方法，獲得了pAdeno Ⅹ-KNDC1重組腺病毒質(zhì)粒。測序結(jié)果顯示目的基因片段KNDC1成功克隆至載體的多克隆位點。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得大量具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒pAdeno Ⅹ-KNDC1。終點稀釋法檢測病毒滴度表明pAdeno Ⅹ-KNDC1重組腺病毒質(zhì)粒滴度能夠達(dá)到1×1011PFU。為了證明pAdeno Ⅹ-KNDC1能夠感染內(nèi)皮細(xì)胞，采用了Western blot進(jìn)行檢測，結(jié)果表明包裝出的病毒顆粒感染HUVEC后，其KNDC1蛋白的表達(dá)量顯著升高。通過SA-β-gal染色證實，pAdeno Ⅹ-KNDC1能夠誘導(dǎo)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，且表現(xiàn)出明顯量效關(guān)系。

綜上所述，本研究采用了新型的腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)pAdeno-Ⅹ成功構(gòu)建出重組人KNDC1腺病毒表達(dá)載體。構(gòu)建的人KNDC1腺病毒表達(dá)載體可用于原代細(xì)胞，為研究KNDC1在細(xì)胞衰老方面的作用提供了可靠的技術(shù)支持。

[1] 王燕，孫曉東，王珺，等. Bmi- 1基因表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的相關(guān)性 [J]. 湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報, 2014,33:318- 320.

[2] Huang J, Furuya A, Hayashi K,etal. Interaction between very-KIND Ras guanine exchange factor and microtubule-associated protein 2, and its role in dendrite growth—structure and function of the second kinase noncatalytic C-lobe domain [J]. FEBS J, 2011,278:1651- 1661.

[3] Zhang C, Zhen YZ, Lin YJ,etal. KNDC1 knockdown protects human umbilical vein endothelial cells from senescence [J]. Mol Med Rep, 2014,10:82- 88.

[4] Darling AJ, Boose JA, Spaltro J. Virus assay methods: accuracy and validation [J]. Biologicals, 1998,26:105- 110.

[5] Lin YJ, Zhen YZ, Wei J,etal. Effects of Rhein lysinate on H2O2-induced cellular senescence of human umbilical vascular endothelial cells [J]. Acta Pharmacol Sin, 2011,32:1246- 1252.

[6] Zhan H, Suzuki T, Aizawa K,etal. Ataxia telangiectasia mutated (ATM)-mediated DNA damage response in oxidative stress-induced vascular endothelial cell senescence [J]. J Biol Chem, 2010,285:29662- 29670.

[7] Sun C, Liu X, Qi L,etal. Modulation of vascular endothelial cell senescence by integrin β4 [J]. J Cell Physiol, 2010,225:673- 681.

[8] 何金生，王健偉，洪濤. 腺病毒載體構(gòu)建原理與方法的研究進(jìn)展 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2001,15:398- 400.

Construction of human recombinant KNDC1adenovirus and its effect of promoting HUVEC senescence

LI Kai-ji1, HAO Xiao-fang1, ZHANG Guang-ling1, WEI Jing-bo1, WEI Jie2, LIN Ya-jun2, ZHEN Yong-zhan1*

(1.Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases,School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000;2.Beijing Hospital & Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China)

Objective To construct the human recombinant KNDC1 adenovirus and to investigate the expression and function of KNDC1 protein in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods Human KNDC1 gene was firstly amplified by PCR and directly cloned into the linearized adenoviral vectorinvitro, followed by screening and gene sequencing. Finally, the linearized recombinant plasmid was transfected into HEK293A cells for packaging. PAdeno Ⅹ-KNDC1 was purified by pAdeno Ⅹ kits and the endpoint dilution method was used for titering recombinant pAdeno Ⅹ-KNDC1. For observing the expression level of KNDC1 proteins, pAdeno Ⅹ-KNDC1 was used to infect HUVECs and then examined by Western blot. The function of pAdeno Ⅹ-KNDC1 was detected by senescence β-galactosidase staining kit. Results Gene sequencing indicated that pAdeno Ⅹ-KNDC1 contained KNDC1 gene. HEK293A cells turned round and partially floated in the tenth day after transfection. The titer was 1×1011PFU. Meantime, significant upregulation of KNDC1 protein expression in HUVECs at 48h after infection was observed. The number of senescence cells was increased with the increase of pAdeno Ⅹ-KNDC1 infection. Conclusions PAdeno Ⅹ-KNDC1 is successfully constructed and can promote the senescence of HUVECs.

KNDC1; adenoviruses; homologous recombination; human umbilical vein endothelial cells

2015- 02- 11

2015- 05- 26

國家自然科學(xué)基金(81001439)；河北省自然科學(xué)基金(H2012401030)；河北聯(lián)合大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃(X2014078)

1001-6325(2015)11-1447-06

Q782

A

*通信作者(corresponding author)：yongzhanzhen @126.com