鐘偉等

【摘要】目的 研究慢性心力衰竭患者血管內(nèi)皮細(xì)胞體外損傷模型的建立辦法。方法 收集心衰患者及健康人血清并干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞活性O(shè)D值、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）、血管假性血友病因子（vWF）、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（sTM）含量并做統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 心衰組CEC、vWF、sTM含量比正常組高（P<0.05）。結(jié)論 慢性心衰患者血清可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

【關(guān)鍵詞】慢性心衰；內(nèi)皮細(xì)胞；模型

【中圖分類號】R54 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

構(gòu)建科學(xué)、客觀的實驗?zāi)Ｐ蛯π乃グl(fā)病機(jī)制及病理過程的研究及臨床診治具重要意義。本研究采用心衰患者的血清作用于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，并通過各項指標(biāo)評價模型的科學(xué)性、客觀性。

實驗材料與方法

一般資料：心衰組30例，年齡62～75歲，男19例，女11例。正常組30例，年齡62～78歲，男17例，女13例。兩組一般資料無差異（P>0.05）。

試劑與設(shè)備：胰蛋白酶、MTT（日本Sigma公司），標(biāo)酶儀（美國biotek），胎牛血清（四季青研究所）、血管內(nèi)假血友病因子（vWF）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（sTM）酶聯(lián)免疫定量檢測（EHSA）試劑盒（美國ADL公司）。

方法：

血清制備：空腹采血5ml，靜置后離心，取上清液制備成血清，恒溫滅活后進(jìn)行過濾除菌分裝，-20℃保存。

致傷模型的建立：將對數(shù)生長期的人臍靜脈分為2組（A組、B組）種入培養(yǎng)板，每組設(shè)30個復(fù)孔，用胎牛血清培養(yǎng)24h后，在A組加入15%心衰患者血清+85%DMEM的條件培養(yǎng)基進(jìn)行損傷造模，在B組加入15%健康人血清+85%DMEM的條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

實驗指標(biāo)觀察：①MTT法檢測細(xì)胞活性 各組細(xì)胞每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入DMSO，自動酶標(biāo)儀震蕩后于490nm處測定吸光值。實驗中設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對照孔。比色時以空白對照孔調(diào)零。②循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)（CEC）的檢測 等密度梯度離心法。將上清稀釋后加入到密度Percoll液中離心，取界面以上液體作為上層，Percoll 層液體作為中層。上層液體離心后棄管中上清液，加生理鹽水。中層震蕩使細(xì)胞懸浮備檢。上述液體滴于血細(xì)胞計數(shù)池中，觀察內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。③vWF和TM水平的檢測 上清液離心后分離血清，-80℃冰箱保存。vWF 濃度測定采用lurell火箭電泳法，TM 濃度測定采用ELISA法。

統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本間均數(shù)比較用t檢驗，多組樣本均數(shù)間比較用方差分析。數(shù)據(jù)處理用SPSS13.0軟件處理。

結(jié)果

組別

注：與健康組比較，★P<0.05。

討論

研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的損傷是多種心血管疾病的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1]。CHF者心泵血量減少，外周循環(huán)血流量減少，組織缺血缺氧，釋放出大量自由基和炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致VEC發(fā)生損傷和功能紊亂[2]。VEC損害主要以內(nèi)皮依賴性舒縮反應(yīng)平衡破壞為特征。因此，構(gòu)建科學(xué)、客觀的細(xì)胞損失模型是保護(hù)及改善VEC功能乃至治療CHF至關(guān)重要的一步，為治療CHF開辟了一條新的途徑。本研究采用機(jī)體的血清作用于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，通過該模型對CHF患者和健康人群的CHF相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀察、比較和探討。

評價VEC損傷程度的代表性指標(biāo)有CEC、vWF和TM。CEC是目前在活體內(nèi)唯一可以特異而直接地反映血管內(nèi)皮損傷的指示物，其增高可反映VEC受損程度。血清vWF含量與VEC受損呈正相關(guān)關(guān)系，因此測定其在血清中濃度可反映血管內(nèi)皮功能狀態(tài)。TM在血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥等病理過程或損傷后被大量釋放至循環(huán)血液中，敏感反映血管內(nèi)皮尤其微血管病變損傷病變。本實驗中可見心衰組吸光值低于健康組， CEC低于健康組，證實心衰患者血清中內(nèi)皮細(xì)胞損傷脫落更明顯；心衰組vWF指標(biāo)和sTM高于健康組，其機(jī)制可能與心衰誘發(fā)血管內(nèi)蛋白等有機(jī)物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)、釋放各種調(diào)節(jié)蛋白入血有關(guān)。

總之，本實驗通過采用心衰患者血清體外致傷血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)造模型，具有客觀、科學(xué)性，為進(jìn)一步研究治療心衰提供奠基作用。不足之處是本實驗研究例數(shù)有限，可能會對結(jié)論的準(zhǔn)確性有影響，需要在今后的試驗中繼續(xù)擴(kuò)大樣本量。

參考文獻(xiàn)

[1] 單莎瑞.自體血管內(nèi)皮祖細(xì)胞抗衰老作用的初步臨床研究[D].廣州：第二臨床醫(yī)學(xué)院，2010年.

[2] Koninckx R，Dani ls A，Windmolders S，et al.The cardiac atrial appendage stem cell： a new and promising candidate for myocardial repair[J].Cardiovasc Res，2013，（03）.