戴冠蘋(píng)，苗良田，孫濤，李清艷，肖冬光，張學(xué)禮

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代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)輔酶Q10

戴冠蘋(píng)1,2,3，苗良田1,2,3，孫濤1,2,3，李清艷2,3，肖冬光1，張學(xué)禮2,3

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 3 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

戴冠蘋(píng), 苗良田, 孫濤, 等. 代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)輔酶Q10. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 206–219.Dai GP, Miao LT, Sun T,et al. Production of coenzyme Q10 by metabolically engineered Escherichia coli. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 206–219.

輔酶Q10(CoQ10) 是一種脂溶性抗氧化劑，具有提高人體免疫力、延緩衰老和增強(qiáng)人體活力等功能，廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)和化妝品行業(yè)。微生物發(fā)酵法能可持續(xù)性生產(chǎn)輔酶Q10，具有越來(lái)越多的商業(yè)價(jià)值。本研究首先將來(lái)自類(lèi)球紅細(xì)菌的十聚異戊二烯焦磷酸合成酶基因 () 整合到大腸桿菌ATCC 8739染色體上，敲除內(nèi)源的八聚異戊二烯焦磷酸合成酶基因 ()，使內(nèi)源的輔酶Q8合成途徑被輔酶Q10合成途徑取代，得到穩(wěn)定生產(chǎn)輔酶Q10的菌株GD-14，其輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)0.68 mg/L，單位細(xì)胞含量達(dá)0.54 mg/g DCW。隨后用多個(gè)固定強(qiáng)度調(diào)控元件在染色體上對(duì)MEP途徑的關(guān)鍵基因和基因以及基因進(jìn)行組合調(diào)控，將輔酶Q10單位細(xì)胞含量提高2.46倍 (從0.54到1.87 mg/g)。進(jìn)一步引入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的Glf轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代替自身的磷酸烯醇式丙酮酸：碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS)，使輔酶Q10產(chǎn)量進(jìn)一步提高16%。最后，對(duì)高產(chǎn)菌株GD-51進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)433 mg/L，單位細(xì)胞含量達(dá)11.7 mg/g DCW。這是目前為止文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌產(chǎn)輔酶Q10最高菌株。

輔酶Q10，同源重組，基因表達(dá)調(diào)控，大腸桿菌

輔酶Q (CoQ)，即2,3-二甲氧基-5-甲基-6-聚異戊二烯醌，又稱泛醌 (Ubiquinone，UQ) 是一種脂溶性醌類(lèi)化合物，含有一個(gè)苯醌環(huán)和不同長(zhǎng)度異戊二烯構(gòu)成的側(cè)鏈[1]，其中側(cè)鏈的異戊二烯單位數(shù)決定著輔酶Q的種類(lèi)。輔酶Q存在于眾多微生物中，如流感嗜血桿菌主要合成CoQ7[2]、大腸桿菌主要合成CoQ8[3]、藤黃微球菌主要合成CoQ9[4]。人類(lèi)主要合成輔酶Q10，含有10個(gè)異戊二烯單位。輔酶Q10在人體有氧呼吸電子傳遞鏈中起重要作用，也是人體重要的抗氧化劑，可以通過(guò)清除自由基和再生生育酚類(lèi)，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)不被氧化[5-7]。輔酶Q10也可以保護(hù)心臟[8]，它是人體產(chǎn)生能量的要素，有助于為心肌提供充足的氧氣，改進(jìn)心肌的代謝，加強(qiáng)心臟的功能?？诜o酶Q10可以預(yù)防和治療心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)性疾病和腦病[9-12]。輔酶Q10另一個(gè)重要應(yīng)用是作為皮膚軟膏的成分，可以減少皺紋[13]。這些重要的生理功能使關(guān)于輔酶Q10的研究不斷增多。

大腸桿菌具有遺傳背景清晰、技術(shù)操作簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，通常作為基因工程宿主菌，用于次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)[3]；并且大腸桿菌可以合成輔酶Q8，其泛醌合成途徑和基礎(chǔ)代謝研究透徹，因此，多個(gè)研究組利用基因工程手段改造大腸桿菌生產(chǎn)輔酶Q10。如將根瘤農(nóng)桿菌[14]、脫氮副球菌[15]和鞘氨醇單胞菌[16]等的十聚異戊二烯焦磷酸合成酶基因 ()，在大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建產(chǎn)輔酶Q10的工程菌株。

對(duì)羥基苯甲酸 (pHBA) 和十聚異戊二烯焦磷酸 (DPP) 是輔酶Q10合成的兩個(gè)重要前體物質(zhì)。所有的類(lèi)異戊二烯側(cè)鏈由共同的合成單位類(lèi)異戊二烯焦磷酸 (IPP) 和它的異構(gòu)體二甲丙烯基焦磷酸 (DMAPP) 合成。目前已知有兩種合成IPP和DMAPP的途徑：一種是甲羥戊酸(Mevalonate，MVA) 途徑，另一種是2-C-甲基- D-赤蘚糖醇-4-磷酸 (MEP) 途徑。MVA途徑主要存在于古生菌、真菌和植物的胞液或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。細(xì)菌和綠色藻類(lèi)，主要利用MEP途徑來(lái)合成IPP和DMAPP。Zhao等用多個(gè)不同強(qiáng)度人工調(diào)控元件對(duì)MEP途徑的基因進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因 () 和異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因 () 是限速基因，提高這兩個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度，β-胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高[17]。Kim等[18]為了提高重組大腸桿菌的輔酶Q10產(chǎn)量，將來(lái)自綠膿假單胞菌的基因以質(zhì)粒的形式過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)輔酶Q10產(chǎn)量提高2倍。

在大腸桿菌中，由分支酸-丙酮酸裂解酶基因 () 編碼的分支酸-丙酮酸裂解酶催化分支酸轉(zhuǎn)化為pHBA，為輔酶Q10的合成提供核心結(jié)構(gòu)苯醌環(huán)；對(duì)羥基苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶基因 () 編碼的對(duì)羥基苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶催化pHBA與聚異戊二烯焦磷酸的縮合是整個(gè)輔酶Q合成的限速酶。Zhang等[19]以質(zhì)粒形式過(guò)表達(dá)基因使輔酶Q10產(chǎn)量提高5倍。強(qiáng)化表達(dá)基因可以顯著提高輔酶Q10的產(chǎn)量。

研究表明用非磷酸烯醇式丙酮酸：碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS) 代替大腸桿菌自身的PTS系統(tǒng)，可以減少磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 的消耗，從而增加丁二酸等以PEP作為前體的代謝產(chǎn)物的合成[20-21]。Tang等分別用半乳糖透性酶 (GalP) 和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的Glf轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (由基因編碼) 代替大腸桿菌的PTS系統(tǒng)使丁二酸產(chǎn)量分別提高20%和41%[22]。PEP是輔酶Q合成必需的前體物質(zhì)，當(dāng)大腸桿菌在以葡萄糖作為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，PTS系統(tǒng)會(huì)消耗50%可用的PEP。

本研究通過(guò)在大腸桿菌中引入外源基因，敲除內(nèi)源八聚異戊二烯焦磷酸合成酶基因 ()，初步構(gòu)建穩(wěn)定生產(chǎn)輔酶Q10的工程菌株。然后，在染色體水平用不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件對(duì)輔酶Q10合成途徑的一系列關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控 (圖1)，且嘗試用的Glf轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代替大腸桿菌自身的PTS系統(tǒng)來(lái)增加輔酶Q10的產(chǎn)量，探索提高工程菌株中輔酶Q10產(chǎn)量的方法，為構(gòu)建高產(chǎn)輔酶Q10的基因工程菌奠定基礎(chǔ)。

圖1 通過(guò)引入外源dps基因在大腸桿菌中構(gòu)建輔酶Q10的合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA marker trans2K plus購(gòu)自大連寶生物工程公司；限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、T4 DNA連接酶、快連酶、T4多聚核苷酸激酶購(gòu)自NEB公司；輔酶Q10標(biāo)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司 (Cat. No. C9538)；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)； PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀 MicroPulser；臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200；離心濃縮儀，Labconco CentriVap 79840-11；7 L發(fā)酵罐，Labfors 4 (Infors Bio-technoligy Co. Ltd)。

1.1.3 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株見(jiàn)表1，本研究所用的質(zhì)粒見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、34、 50 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

無(wú)鹽蔗糖培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10%的蔗糖。無(wú)鹽蔗糖固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中含10 g甘油、1.7 g檸檬酸、10.5 g KH2PO4·3H2O、 6 g (NH4)2HPO4、3.44 g MgSO4·7H2O、10 mL微量元素溶液。微量元素溶液的成分：1 L溶液中含10 g FeSO4·7H2O、5.25 g ZnSO4·7H2O、3.0 g CuSO4·5H2O、0.5 g MnSO4·4H2O、0.23 g Na2B4O7·10H2O、2.0 g CaC12、0.1 g (NH4)6Mo7O24。補(bǔ)料培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中含 500 g甘油、15 g蛋白胨、30 g酵母提取物、30 g MgSO4·7H2O。

好氧培養(yǎng)：將保存于–80 °C的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm× 100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 °C、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL三角瓶 (10 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 °C、250 r/min 培養(yǎng)24 h。收集菌液用于測(cè)定輔酶Q10含量。

表1 本研究所用的菌株

表2 本研究所用的質(zhì)粒

1.2.2 表達(dá)外源基因的質(zhì)粒構(gòu)建

以類(lèi)球紅細(xì)菌的總DNA為模板，使用引物Rsdps-Ⅰ-up和Rsdps-Ⅰ- down (表3) 擴(kuò)增的基因片段 ()。將純化后的基因片段用Ⅰ和Ⅰ雙酶切，質(zhì)粒pACYC184-M2-P12用Ⅰ和Ⅰ雙酶切，純化后用Quick ligase DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化trans10感受態(tài)細(xì)胞，在含有硫酸卡那霉素的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑選單克隆，使用引物Km-F和Rsdps-349-r (表3) 進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的克隆提取質(zhì)粒測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pACYC184-rsdps-P12。

1.2.3 外源基因和基因的染色體整合

用一步同源重組法[23]，將的基因整合到大桿菌ATCC 8739的位點(diǎn)。使用引物pflB-up-FRT和pflB-down-ter，以質(zhì)粒pACYC184-rsdps-P12為模板，擴(kuò)增DNA片段 (包括與插入位點(diǎn)同源的50 bp同源臂、基因和FRT--FRT::M1-12片段)，將純化后的片段電轉(zhuǎn)入含有pKD46的ATCC 8739的感受態(tài)細(xì)胞中。在含有硫酸卡那霉素的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選單克隆，用引物Km-F和Rsdps-349-r進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的克隆命名為GD-13-Km。根據(jù)Datsenko描述的方法[25]去除GD-13-Km中的FRT--FRT，得到重組菌株GD-13。

來(lái)自的帶有M1-12人工調(diào)控元件的基因的整合采用兩步同源重組的方法。首先，使用引物ptsI-catsacB-up和ptsI-catsacB-down擴(kuò)增出基因片段Ⅰ，進(jìn)行第一步同源重組，將重組菌株GD-44的基因替換為基因簇。然后，以重組菌株Glf12[22]的DNA為模板，使用引物ptsI-up和ptsI-down (表3) 擴(kuò)增DNA片段Ⅱ(包括插入位點(diǎn)同源片段和帶有M1-12人工調(diào)控元件的基因) 進(jìn)行第二步同源重組，將基因簇替換為帶有M1-12人工調(diào)控元件的基因，得到菌株GD-51。

1.2.4 無(wú)痕基因敲除及基因調(diào)控

采用兩步同源重組法，對(duì)基因進(jìn)行敲除和調(diào)控，獲得的重組菌株中無(wú)抗生素基因和FRT序列殘留[26-27]。

采用兩步同源重組的方法敲除重組菌株GD-13的基因[27]，得到重組菌株GD-14。

使用不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件，采用兩步同源重組的方法，對(duì)基因進(jìn)行染色體水平調(diào)控。調(diào)控元件M1-12、M1-46、M1-37和M1-93的強(qiáng)度，分別是大腸桿菌誘導(dǎo)后啟動(dòng)子的0.1、1.7、2.5和5倍[23]。

對(duì)基因的調(diào)控，使用引物dxs-cat-up和dxs-sacB-down，以pXZ-CS[24]為模板，PCR擴(kuò)增出基因片段Ⅰ，純化后進(jìn)行第一步同源重組，將菌株GD-14的基因的原始啟動(dòng)子替換為基因簇。使用引物dxs-up-p和dxs-RBS-down，以M1-37菌株的基因組DNA為模板[23]，PCR擴(kuò)增出含M1-37人工調(diào)控元件的DNA片段Ⅱ，進(jìn)行第二步同源重組，將基因簇替換為人工調(diào)控元件M1-37，得到重組菌株DXS-37。

表3 本研究所用的引物

續(xù)表3

ubiC-365-rGATGTGAACAGATAGCGTCC pflB-up-catAAAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCATGTGACGGAAGATCACTTCGCA p-down-sacBGGCTCAATTATATCAACGTTGTTATCTCTTGTCAACACCGCCAGAGATAATTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT pflB-up-PAAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCATTATCTCTGGCGGTGTTGAC Rsdps-RBS-downTCGGCCGACAGCCGGTCGAGCGGCTTGGAGACGTTTTCGTTCATGCCCATAGCTGTTTCCTGGTT ptsI-catsacB-upTGTGGTGAGCTTGCTGGCGATGAACGTGCTACACTTCTGTTGCTGGGGATTGTGACGGAAGATCACTTCGCA ptsI-catsacB-downATGATCTTCTCCTAAGCAGTAAATTGGGCCGCATCTCGTGGATTAGCAGA TTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT ptsI-upCGCATTATGTTCCCGATGAT ptsI-downGCCTTTCAGTTCAACGGTGT

采用上述同樣的方法對(duì)、和基因進(jìn)行調(diào)控。

上述調(diào)控所用引物序列見(jiàn)表3，構(gòu)建菌株見(jiàn)表1。

1.2.5 菌株GD-51的分批補(bǔ)料發(fā)酵

參照Z(yǔ)hao等的研究[17]，將輔酶Q10產(chǎn)量最高的重組大腸桿菌GD-51在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。發(fā)酵溫度37 °C，空氣流量4 L/min，溶氧控制在30%。在批次發(fā)酵階段，為了使溶氧控制在30%，轉(zhuǎn)速需與溶氧偶聯(lián)，轉(zhuǎn)速在400? 1 200 r/min之間變化。在溶氧反彈點(diǎn) (初始碳源消耗完) 之后轉(zhuǎn)速一直保持在1 200 r/min，采用模擬指數(shù)流加補(bǔ)料方式進(jìn)行補(bǔ)料[28]。通過(guò)控制補(bǔ)料量使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程甘油濃度保持在0.5 g/L以下，使用5 mol/L氨水將pH控制在7.0。

1.2.6 輔酶Q10產(chǎn)量的檢測(cè)方法

參照Park等的研究[29]，對(duì)菌體中的輔酶Q10進(jìn)行提取和HPLC檢測(cè)。每次取4 mL菌液，離心收菌，破碎細(xì)胞，用正己烷和正丙醇的混合液 (體積比5∶3) 萃取兩次，用真空離心濃縮儀真空干燥，得到少量固體，加入無(wú)水乙醇溶解，使用HPLC檢測(cè)輔酶Q10產(chǎn)量。因?yàn)檩o酶Q10不能被完全萃取，用上述方法，在菌體中加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到的輔酶Q10回收率是60.4%，用來(lái)矯正輔酶Q10產(chǎn)量[29]。烘干菌體測(cè)得每升每600的培養(yǎng)物中含0.343 g干細(xì)胞，用以換算單位干細(xì)胞中輔酶Q10產(chǎn)量。

用高效液相色譜檢測(cè)輔酶Q10產(chǎn)量。檢測(cè)條件：DAD檢測(cè)器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為無(wú)水乙醇，流速 0.8 mL/min，柱溫30 °C，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間20 min，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。每個(gè)待測(cè)樣品分別有3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。用購(gòu)自Sigma公司的輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建輔酶Q10的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因的表達(dá)

大腸桿菌本身沒(méi)有合成輔酶Q10的能力，但是引入外源基因后，大腸桿菌就可以生產(chǎn)輔酶Q10。克隆s的基因，構(gòu)建質(zhì)粒pACYC184-rsdps-P12，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌ATCC 8739中，來(lái)合成輔酶Q10。

在轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pACYC184-rsdps-P12的大腸桿菌中，檢測(cè)到輔酶Q10的合成，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到1.24 mg/L，單位細(xì)胞含量為0.68 mg/g DCW (表4)，說(shuō)明質(zhì)粒pACYC184-rsdps-P12中s的基因可以表達(dá)、具有催化合成輔酶Q10的能力。

2.2 染色體整合外源基因并敲除內(nèi)源基因

由于質(zhì)粒表達(dá)不穩(wěn)定，并且發(fā)酵時(shí)需要添加抗生素，因此將外源基因整合到大腸桿菌染色體上。同時(shí)，將大腸桿菌自身的基因敲除，以減少代謝副產(chǎn)物輔酶Q8的積累，同時(shí)達(dá)到提高輔酶Q10產(chǎn)量的目的。

將s的基因整合到ATCC 8739染色體上，得到重組菌株GD-13。然后，敲除內(nèi)源基因，得到重組菌株GD-14。對(duì)菌株GD-13和GD-14進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)輔酶Q10進(jìn)行提取和HPLC檢測(cè)。

分析HPLC檢測(cè)色譜圖 (圖2)，重組大腸桿菌GD-13既有輔酶Q10合成，又有輔酶Q8合成；敲除了內(nèi)源基因后，只有輔酶Q10合成，與預(yù)期結(jié)果一致。

分析輔酶Q10產(chǎn)量 (表4)，敲除基因，輔酶Q10產(chǎn)量有顯著提高，GD-14的單位細(xì)胞含量與GD-13相比提高135%。說(shuō)明敲除基因，可以阻止輔酶Q8的合成，從而提高輔酶Q10的產(chǎn)量，這與Choi等的研究結(jié)果一致[30]。

圖2 輔酶Q10的HPLC檢測(cè)色譜圖

表4 染色體整合外源dps基因及敲除內(nèi)源ispB基因后輔酶Q10的產(chǎn)量

aThree repeats were performed for each strain, and the error bars represented standard deviation.

2.3 調(diào)控MEP途徑的關(guān)鍵基因

DPP是輔酶Q10合成的一個(gè)重要前體，調(diào)控MEP途徑，可以增加IPP、DMAPP的供給，從而增加碳流向DPP的合成。Zhao等[17]的研究表明，調(diào)控MEP途徑的關(guān)鍵基因和，可以顯著提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，而輔酶Q10側(cè)鏈與β-胡蘿卜素的合成有相同的前體，因此認(rèn)為采用同樣方法對(duì)和基因進(jìn)行調(diào)控，可以有效提高輔酶Q10產(chǎn)量。

對(duì)MEP途徑的和基因調(diào)控后得到重組菌株GD-21，其輔酶Q10產(chǎn)量為0.68 mg/L，單位細(xì)胞含量為0.53 mg/g DCW，與GD-14幾乎一樣 (圖3)。這與Zhao等的研究不一致[17]，推測(cè)可能另一前體物質(zhì)pHBA供給不足限制了輔酶Q10的合成，或者基因表達(dá)量不足，即使細(xì)胞內(nèi)有足夠的前體物質(zhì)IPP和DMAPP存在，也不能合成足夠多的DPP，從而限制輔酶Q10的合成。

2.4 調(diào)控基因

pHBA是輔酶Q10合成的另一前體，在大腸桿菌中，由基因編碼的分支酸-丙酮酸裂解酶催化合成?；蚓幋a的對(duì)羥基苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶催化pHBA與聚異戊二烯焦磷酸的縮合是整個(gè)輔酶Q合成的限速酶。并且和處于同一個(gè)操縱子下，過(guò)表達(dá)可以顯著增加輔酶Q10產(chǎn)量[19]。因此從GD-14出發(fā)，用3個(gè)強(qiáng)度的人工調(diào)控元件(M1-46、M1-37和M1-93) 對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控，得到菌株GD-22、GD-23和GD-24。

基因調(diào)控后，輔酶Q10產(chǎn)量均有提高，單位細(xì)胞含量與GD-14相比，分別提高105%、91%和117%，其中調(diào)控為M1-93的菌株GD-24輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)到1.41 mg/L，單位細(xì)胞含量為1.17 mg/g DCW (圖3)。調(diào)控基因，可以有效提高Q10產(chǎn)量，說(shuō)明大腸桿菌輔酶Q10的整個(gè)合成途徑中對(duì)羥基苯甲酸的供給以及其與DPP的縮合是關(guān)鍵的限速步驟。

2.5 組合調(diào)控MEP途徑和基因

調(diào)控后，MEP途經(jīng)的IPP和DMAPP供給可能成為輔酶Q10合成的限速步驟。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，對(duì)MEP途經(jīng)和基因進(jìn)行組合調(diào)控。將菌株GD-21的基因的原始啟動(dòng)子調(diào)控為人工調(diào)控元件M1-46、M1-37和M1-93，得到重組菌株GD-31、GD-32和GD-33。

MEP途經(jīng)和基因組合調(diào)控后，輔酶Q10產(chǎn)量均有顯著提高，單位細(xì)胞含量與GD-21相比分別提高210%、217%和174%，與GD-22、GD-23和GD-24相比分別提高50%、64%和25% (圖3)。菌株GD-32的產(chǎn)量最高，其輔酶Q10產(chǎn)量為1.94 mg/L，1.70 mg/g DCW。說(shuō)明調(diào)控后，IPP和DMAPP前體供應(yīng)成了另一個(gè)限制因素，只有同時(shí)充分供給兩個(gè)前體物質(zhì)，才能使輔酶Q10產(chǎn)量更高。

2.6 調(diào)控基因

由于在大腸桿菌染色體上只整合了一個(gè)拷貝且?guī)в邢鄬?duì)低強(qiáng)度調(diào)控元件(M1-12) 的基因，十聚異戊二烯焦磷酸合成酶表達(dá)不足可能限制輔酶Q10的合成。為了進(jìn)一步提高輔酶Q10的產(chǎn)量，分別用人工調(diào)控元件M1-37和M1-93組合調(diào)控菌株GD-32的基因，得到菌株GD-43和GD-44。

基因調(diào)控為M1-93的菌株GD-44輔酶Q10產(chǎn)量最高，產(chǎn)量達(dá)2.21 mg/L，單位細(xì)胞含量達(dá)1.87 mg/g DCW，與GD-32相比增加10% (表5)?；蛘{(diào)控后產(chǎn)量增加不明顯，然而據(jù)Zhao等的研究[17]，調(diào)控和基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)18.40 mg/g DCW，如果合成β-胡蘿卜素的前體IPP和DMAPP全部用來(lái)合成輔酶Q10，理論上應(yīng)該達(dá)到約23.67 mg/g DCW，可能目前DPP并不是輔酶Q10合成的限制因素，pHBA的供給不足或者下游醌環(huán)修飾途徑的酶表達(dá)不夠等限制了輔酶Q10的合成。

2.7 引入的基因

為了增加PEP的供給從而提高輔酶Q10的產(chǎn)量，將來(lái)自的帶有M1-12人工調(diào)控元件的基因插入重組大腸桿菌GD-44的位點(diǎn)，敲除大腸桿菌自身的PTS系統(tǒng)，既減少PEP的消耗，又保證葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。

引入的帶有M1-12人工調(diào)控元件的基因，得到菌株GD-51，其輔酶Q10單位細(xì)胞含量與GD-44相比增加16% (表5)。說(shuō)明通過(guò)引入的Glf轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以進(jìn)一步增加輔酶Q10的產(chǎn)量。

圖3 調(diào)控MEP途徑和ubiCA基因后重組大腸桿菌的輔酶Q10產(chǎn)量

表5 調(diào)控dps基因和引入外源glf基因后重組大腸桿菌的輔酶Q10產(chǎn)量

aThree repeats were performed for each strain, and the error bars represented standard deviation.

2.8 菌株GD-51的分批補(bǔ)料發(fā)酵

對(duì)高產(chǎn)輔酶Q10的重組菌株GD-51在7 L發(fā)酵罐中，進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。在批次發(fā)酵階段，轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)，溶氧穩(wěn)定在30%左右。第10 h，初始碳源消耗完，溶氧反彈，開(kāi)始補(bǔ)料發(fā)酵。首先，采用模擬指數(shù)流加的補(bǔ)料策略，補(bǔ)料3.5 h，補(bǔ)料量指數(shù)增加 (15.7?26.1 mL/h)。如果持續(xù)指數(shù)流加策略，則會(huì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，產(chǎn)生過(guò)量乙酸從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，13.5 h之后采用26.1 mL/h的速度恒速補(bǔ)料。細(xì)胞在47 h進(jìn)入穩(wěn)定期，為了減少副產(chǎn)物乙酸的積累，發(fā)酵后期從60 h至 78 h，階段性的降低補(bǔ)料速度 (圖4)。

發(fā)酵周期是78 h，最高的600是118，干重為41.6 g/L，輔酶Q10產(chǎn)量最高達(dá)433 mg/L，單位細(xì)胞輔酶Q10含量達(dá)11.7 mg/g DCW (圖5)。與搖瓶發(fā)酵相比，分批補(bǔ)料發(fā)酵使重組菌株GD-51的600增加約31倍，輔酶Q10單位細(xì)胞含量提高約4.4倍，這說(shuō)明分批補(bǔ)料發(fā)酵，既可以增加細(xì)胞量還可以提高輔酶Q10產(chǎn)量。推測(cè)認(rèn)為，與搖瓶實(shí)驗(yàn)相比，分批補(bǔ)料發(fā)酵能很好地限制碳源的供給，降低代謝副產(chǎn)物乙酸的積累。另外，發(fā)酵過(guò)程中控制pH在7.0，攪拌增加溶氧等為細(xì)胞提供了合適的生長(zhǎng)條件。這些因素導(dǎo)致分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)輔酶Q10的單位細(xì)胞產(chǎn)量大于搖瓶實(shí)驗(yàn)。

圖4 分批補(bǔ)料發(fā)酵GD-51菌株過(guò)程中甘油濃度、溶氧和補(bǔ)料速度的變化

圖5 分批補(bǔ)料發(fā)酵GD-51菌株，生物量以及輔酶Q10產(chǎn)量的變化

3 結(jié)論

本研究在大腸桿菌中引入外源基因，敲除內(nèi)源基因，然后分別對(duì)MEP途徑的和基因以及基因進(jìn)行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)只有輔酶Q10的兩個(gè)前體DPP和pHBA同時(shí)供給充足，才能使輔酶Q10產(chǎn)量更高。另外，首次用的Glf轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代替大腸桿菌自身的PTS系統(tǒng)，使輔酶Q10產(chǎn)量進(jìn)一步提高，證明構(gòu)建非PTS葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)這一策略可用于提高PEP供給從而提高輔酶Q10的生產(chǎn)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Production of coenzyme Q10by metabolically engineered

Guanping Dai1,2,3, Liangtian Miao1,2,3, Tao Sun1,2,3, Qingyan Li2,3, Dongguang Xiao1, and Xueli Zhang2,3

1,,300457,2,,300308,3,,300308,

Coenzyme Q10(CoQ10) is a lipophilic antioxidant that improves human immunity, delays senility and enhances the vitality of the human body and has wide applications in pharmaceutical and cosmetic industries. Microbial fermentation is a sustainable way to produce CoQ10, and attracts increased interest. In this work, the native CoQ8synthetic pathway ofwas replaced by the CoQ10synthetic pathway through integrating decaprenyl diphosphate synthase gene () frominto chromosome ofATCC 8739, followed by deletion of the native octaprenyl diphosphate synthase gene (). The resulting strain GD-14 produced 0.68 mg/L CoQ10with a yield of 0.54 mg/g DCW. Modulation ofandgenes of the MEP pathway andgenes in combination led to 2.46-fold increase of CoQ10production (from 0.54 to 1.87 mg/g DCW). Recruiting glucose facilitator protein ofto replace the native phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems (PTS) further led to a 16% increase of CoQ10yield. Finally, fed-batch fermentation of the best strain GD-51 was performed, which produced 433 mg/L CoQ10with a yield of 11.7 mg/g DCW. To the best of our knowledge, this was the highest CoQ10titer and yield obtained for engineered.

CoQ10, homologus recombination, modulation of gene expression,

April 8, 2014; Accepted: May 12, 2014

Xueli Zhang. Tel/Fax: 86-22-84861983; E-mail: zhang_xl@tib.cas.cn Qingyan Li. Tel/Fax: 86-22-84861946; E-mail: li_qy@tib.cas.cn

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