李昊媧,武 乾,石曉璐,孫明杰,林 謙

·心律失常專題·

益氣復(fù)脈合劑抗心律失常作用機(jī)制研究

李昊媧1,武 乾2,石曉璐2,孫明杰2,林 謙3

目的利用膜片鉗技術(shù)闡述益氣復(fù)脈合劑抗心律失常作用機(jī)制。方法采用膠原酶法急性分離大鼠左心室肌細(xì)胞,利用膜片鉗技術(shù),記錄心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位。結(jié)果異丙腎上腺素(Iso)灌流前,中藥組動(dòng)作電位時(shí)程(APD)、APD50、APD90較空白對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05);Iso灌流后,空白對(duì)照組與中藥組APD較灌流前顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01),空白對(duì)照組APD50、APD90較灌流前亦顯著延長(zhǎng)(P<0.01);給Iso后,中藥組APD、APD50、APD90較空白對(duì)照組顯著縮短(P<0.01)。結(jié)論益氣復(fù)脈合劑可以縮短Iso引起的APD的延長(zhǎng),可能與抑制平臺(tái)期Ca2+電流和復(fù)極后期K+電流有關(guān)。

心律失常;益氣復(fù)脈合劑;動(dòng)作電位;膜片鉗;異丙腎上腺素

心肌細(xì)胞的工作基礎(chǔ)取決于心肌細(xì)胞膜的跨膜離子流,多種跨膜離子流的復(fù)雜變化產(chǎn)生心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位和靜息電位,即動(dòng)作電位和靜息電位是多種離子通道綜合作用的結(jié)果[1,2]。既往研究中發(fā)現(xiàn)益氣復(fù)脈合劑具有抗室性心律失常作用[3]。中藥益氣復(fù)脈合劑在整體實(shí)驗(yàn)研究中已顯示其抗心律失常作用,因此本實(shí)驗(yàn)就其抗心律失常作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠,體重200 g±20 g,購(gòu)自北京華康生物科技股份有限公司,許可證編號(hào):SCXK(京)2009-0007。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥物 滲透壓儀Fiske 210(美國(guó)ADVANCE公司);DMI-UniversalPuller拉制儀;膜片鉗放大器EPC 10(美國(guó)HEKA公司);微操M(fèi)P-225 (美國(guó)SUTTER INSTRUMENT COMPANY);顯微鏡IX71(日本OLYMPUS公司);微電極B15014F(武漢微探科學(xué)儀器有限公司);pH劑PB-21(德國(guó)Sartorius公司);純水機(jī)Elix、抽濾泵及濾膜(美國(guó)MIILIPORE公司);恒溫水浴鍋(美國(guó)Poly Science公司);BT100-2J蠕動(dòng)泵。

益氣復(fù)脈合劑(黨參、黃連、半夏、鬼箭羽、川芎、丹參、赤芍、白芍、炙甘草、酸棗仁和遠(yuǎn)志),藥物終濃度4.13 g/mL。異丙腎上腺素、二甲基亞砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司;Collagenase type 2購(gòu)自Washington公司,其余試劑藥物購(gòu)自Alfa公司。

1.1.3 主要溶液配制 無(wú)鈣臺(tái)氏液(Tyrode solution):NaCl 140.0 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPEs 10.0 mmol/L,D-Glucose 10.0 mmol/L, NaOH調(diào)至pH 7.4;有鈣臺(tái)式液:在無(wú)鈣臺(tái)式液基礎(chǔ)上加1.8 mmol/L CaCl2;KB液:KOH 80.0 mmol/L,KCl40.0 mmol/L,KH2PO425.0 mmol/L,MgSO43.0 mmol/L,LGlutamic50.0mmol/L,Taurine20.0mmol/L,EGTA 1.0 mmol/L,D-Glucose 10.0 mmol/L,KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2;消化液:含60%Collagenase type 2+20%BSA+50 μmol/L Ca2+的無(wú)鈣臺(tái)氏液;動(dòng)作電位電極內(nèi)液:NaCl 10.0 mmol/L,KCl 120.0 mmol/L,MgCl25.0 mmol/L, HEPEs 20.0 mmol/L,EGTA 5.0 mmol/L,Na2ATP 3.0 mmol/L,KOH調(diào)節(jié)至pH7.2;給藥溶液:為有鈣臺(tái)式液+10μmol/L異丙腎上腺素(Iso);浴槽溶液:為有鈣臺(tái)式液。

1.2 方法 空白對(duì)照組(WT)給予蒸餾水3.48 mL/(kg·d)灌胃;中藥組(CM)給予益氣復(fù)脈合劑3.48 mL/(kg·d)灌胃,給藥7 d,采用膠原酶法急性分離大鼠左心室肌細(xì)胞。于術(shù)前15 min腹腔注射肝素(1 000 U/kg),10%水合氯醛溶液(0.35 g/kg)麻醉,開(kāi)胸,迅速取出帶有一段主動(dòng)脈的心臟,置于4℃臺(tái)式液中清理和沖洗殘余血液,并迅速掛于Langendorff裝置上進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌注,在36.7℃,6 mL/min,恒速灌流。100%氧氣飽和的有鈣臺(tái)式液灌流約3 min后切換100%氧氣飽和的無(wú)鈣臺(tái)式液灌流5 min,然后迅速切換消化液循環(huán)灌流,并持續(xù)通以100%氧氣。灌流中同步監(jiān)測(cè)灌注壓,當(dāng)灌注壓恢復(fù)到略低于初始灌流壓力時(shí),終止消化,此時(shí)心臟顏色變淺,觸之松軟。用10 mL無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流沖洗殘余消化液,然后于KB液中剪取左心室。用眼科剪沿心室中部橫軸剪開(kāi)心臟,置入KB液中,撕碎,以吸管小心吹打,200目篩網(wǎng)過(guò)濾,500 r/min離心約30 s。棄去上清液,更換KB液一次,間隔6 min再次更換KB液,KB液中保存。

1.3 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

1.3.1 電極制備 選用內(nèi)徑1.05 mm,外徑1.5 mm,壁厚0.45 mm的軟質(zhì)玻璃毛細(xì)管,置于微管電極拉制儀上,經(jīng)三步拉制,剖光而成。充灌電極液后電極阻抗為2 MΩ～6 MΩ。

1.3.2 全細(xì)胞膜片鉗電流記錄 采用全細(xì)胞電流技術(shù)記錄模式C-CLAMP。細(xì)胞浴槽保持恒速灌流。

1.3.3 高阻抗封接 實(shí)驗(yàn)前先將存放于高鉀KB液中的細(xì)胞逐步復(fù)鈣,分別用0.6 mmol/L,1.2 mmol/L,1.8 mmol/L含Ca2+臺(tái)式液梯度復(fù)鈣,間隔6 min。靜置半小時(shí)后可用于細(xì)胞動(dòng)作電位的測(cè)量。取幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池(約1 mL),平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上,靜置10 min,待細(xì)胞充分貼壁后,用臺(tái)式液灌流,流速為2 mL/min。玻璃電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液,電阻為2 MΩ～6 MΩ。選取桿狀、橫紋清晰、無(wú)自主收縮的心室肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電極降入細(xì)胞外液前對(duì)電極給予正壓,以防止入液后電極尖端被雜質(zhì)沾染。電極入液后,點(diǎn)擊入液補(bǔ)償,補(bǔ)償記錄電極與參考電極之間的電位差。調(diào)節(jié)微操使電極尖端逐漸向所選定的細(xì)胞靠近。當(dāng)電極尖端接觸到細(xì)胞膜時(shí),施以輕微的負(fù)壓,待回路電阻值迅速升至GΩ水平,表明電極與細(xì)胞膜之間的高電阻封接(gigaseal)已經(jīng)形成。

1.3.4 全細(xì)胞模式 高阻抗(>1 GΩ)封接形成后,補(bǔ)償電極電容。然后負(fù)壓輕吸細(xì)胞膜并逐漸加力,直至可見(jiàn)原為一條直線的電流圖突然出現(xiàn)較大的細(xì)胞電容電流,這時(shí)便形成了全細(xì)胞模式,破膜后電阻大于100 MΩ。予細(xì)胞電容補(bǔ)償,使圖形盡量平直。

1.3.5 刺激參數(shù)的設(shè)置 本實(shí)驗(yàn)記錄的是大鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位(action potential,AP)。刺激模式為脈寬5 ms,電流900 pA。

1.3.6 檢測(cè)指標(biāo) 用Patch Clamp記錄動(dòng)作電位,當(dāng)在臺(tái)式液中記錄到動(dòng)作電位后,穩(wěn)定10 min,轉(zhuǎn)換為加有10μmol/L異丙腎上腺素的灌流液,灌流30 min。記錄加Iso前后的靜息電位(resting potential,RP)、動(dòng)作電位幅度(action potential amplitude,APA)、超射(overshoot,OS)、動(dòng)作電位最大除極速率(maximum, Vmax)、動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration, APD)、動(dòng)作電位復(fù)極至25%、50%、90%的時(shí)間(action potential duration at 25%、50%、90%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Fit Clamp、Origin 8.0、Excel 2007、SPSS 17.0處理并統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)(t-test),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離后心室肌細(xì)胞鏡下形態(tài)(見(jiàn)圖1)

圖1 40×鏡下心室肌細(xì)胞形態(tài)

2.2 兩組RP、OS、APA及Vmax比較 Iso灌流前后兩組組間及組內(nèi)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 心室肌細(xì)胞靜息電位、超射、幅度及最大上升率比較±s)

表1 心室肌細(xì)胞靜息電位、超射、幅度及最大上升率比較±s)

時(shí)間組別_______n______________RP(mV)OS(mV)APA(mV)Vmax(V/s)灌流前WT10-67.18±0.3648.90±2.16113.70±4.19111.55±7.20 CM10-67.33±0.2347.03±5.59113.60±8.17117.32±8.61灌流后WT10-67.69±1.1348.40±10.33112.01±8.86113.64±10.59 _______________CM________10__________-67.52±0.4_______________________________________________________________________________________ 7 47.55±4.00113.94±5.76112.26±7.55

2.3 兩組動(dòng)作電位時(shí)程比較(見(jiàn)表2及圖2) Iso灌流前,中藥組APD、APD50、APD90較空白對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05);Iso灌流后,空白對(duì)照組與中藥組APD較灌流前顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01),且空白對(duì)照組APD50、APD90亦顯著延長(zhǎng)(P<0.01);Iso灌流后,中藥組APD、APD50、APD90較空白對(duì)照組顯著縮短(P<0.01)。

表2 心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程比較表(±s)

表2 心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程比較表(±s)

時(shí)間組別n APDAPD25灌流前WT1072.83±7.49 6.63±1.1117 CM1077.64±5.981)6.23±2.2420灌流后WT10116.15±10.284)6.51±1.6030 CM1083.835.132)3)6.543.0522 APD50APD90 .54±1.11 50.78±3.06 .15±2.451)55.07±4.861).99±2.894)82.43±5.824)± ± .14±2.322)59.90±8.562)與WT比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與同組灌流前比較,3)P<0.05,4)P<0.01。

圖2 心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位

3 討 論

APA可以反映Na+內(nèi)流的總量,是鈉離子通道功能的表現(xiàn)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,異丙腎上腺素干預(yù)前后,益氣復(fù)脈合劑組和空白對(duì)照組的APA及Vmax無(wú)差異,提示其作用機(jī)制并未顯著體現(xiàn)在Na+通道上。

異丙腎上腺素干預(yù)前,中藥組APD、APD50、APD90較空白對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。心室肌APD的延長(zhǎng)主要和Ca2+內(nèi)流以及K+外流有關(guān),這兩種電流是心室肌復(fù)極2期的主要電流,推測(cè)APD、APD50、APD90的延長(zhǎng)可能是對(duì)Ca2+內(nèi)流或K+外流發(fā)揮了抑制作用[5]。APD90反映的是心室肌細(xì)胞3期復(fù)極化時(shí)程,這一過(guò)程主要是外向K+離子流的激活。適度延長(zhǎng)APD,從而可以延長(zhǎng)心室肌細(xì)胞的有效不應(yīng)期,能夠有助于折返性心動(dòng)過(guò)速的防治。

異丙腎上腺素干預(yù)后,空白對(duì)照組與中藥組APD均顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01),異丙腎上腺素與β受體結(jié)合后,通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)升高,通過(guò)蛋白激酶A引起鈣通道蛋白的磷酸化,對(duì)細(xì)胞膜上的鈣、鉀等離子通道蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾,導(dǎo)致L型鈣通道構(gòu)型改變,使功能性鈣通道數(shù)目增加,使細(xì)胞膜上有功能的通道數(shù)量增加或通道開(kāi)放幾率增加或單通道電導(dǎo)增高,從而使相應(yīng)的離子流(ICaL、IK)增大[6,7]。鈣窗電流增加,產(chǎn)生EAD和DAD[8,9],延長(zhǎng)了動(dòng)作電位時(shí)程并提高了平臺(tái)期電位水平。而異丙腎干預(yù)后,中藥組較空白對(duì)照組的APD、APD50、APD90顯著縮短(P<0.01),推斷中藥益氣復(fù)脈合劑可能是通過(guò)抑制Ca2+和K+電流而起到抗心律失常作用。

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Study on Mechanisms with Ant i-arrhythmic Effects of Yiqi Fumai Mixture

Li Haowa,Wu Qian,Shi Xiaolu,Sun Mingjie,Lin Qian
Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing 100029,China Corresponding Author:Lin Qian(Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)

ObjectiveTo investigate the ant i-arrhythmic mechanisms with Yiqi Fumai mixture(YFM)by the patc h-clamp technique.MethodsUsing the collagenase method in acutely isolated rat left ventricular myocytes,and using patch clamp techique,to record the action potential of ventricular myocytes.ResultsBefore isoprenaline(Iso)perfusion,compared with the control group,the Ch-i nese medicine(CM)group could significantly extend action potential duration(APD),APD50 and APD90(P<0.05).After Iso perfusion,the control group and the CM group could significantly extend APD(P<0.05 orP<0.01),and the control group also could significantly extend APD50 and APD90(P<0.01).After Iso perfusion,compared with the control group,the CM group could signif-i cantly shortening APD,APD50 and APD90(P<0.01).ConclusionIt suggests that YFM can against the prolongation of APD caused by Iso,maybe related to the inhibiton of the late plateau Ca2+current and repolarization K+current.

arrhythmia;Yiqi Fumai mixture;action potential;patch clamp;isoprenaline

R541.7R289.5

:A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.002

:1672-1349(2015)02-0132-03

2014-12-26)

(本文編輯郭懷印)

1.北京安貞醫(yī)院(北京100029);2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院

林謙,E-mail:linqian62@126.com