侯春園，喬增瑩，喬圣林，安紅維，趙文靜，李效軍

（1.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130；2.國家納米科學(xué)中心納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

侯春園1，喬增瑩2，喬圣林2，安紅維2，趙文靜1，李效軍1

（1.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130；2.國家納米科學(xué)中心納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

以1,6-己二醇二丙烯酸酯（HDDA），N,N-二丁基丙二胺（DBPA），雙氨基聚乙二醇（NH2-PEG-NH2，Mn =2 000 Da）為原料，通過邁克爾加成反應(yīng)以不同比例合成了pH響應(yīng)性的聚氨基酯化合物，用核磁表征了其結(jié)構(gòu)．這類兩親性的聚合物可以自發(fā)聚集形成膠束狀納米粒，用透射電子顯微鏡（TEM）表征了其形貌和粒徑，納米粒度分析儀（DLS）測(cè)定其水合粒徑約30～40 nm，用GPC測(cè)得聚氨基酯化合物的分子量均在20 000以上．通過芘熒光測(cè)試和尼羅紅熒光測(cè)試研究了納米粒在酸性條件下（pH 5～6）的解散行為，驗(yàn)證了聚氨基酯化合物的pH響應(yīng)性能．

聚氨基酯；邁克爾加成；納米粒；pH響應(yīng)性；熒光測(cè)試

0 前言

近年來，多功能聚合物在藥物遞送方面的應(yīng)用迅速發(fā)展[1-5]．聚氨基酯（PBAEs）類聚合物具有較低的細(xì)胞毒性，能夠生物降解，促進(jìn)藥物在胞內(nèi)釋放以及結(jié)構(gòu)多樣等優(yōu)點(diǎn)．它們由胺與雙丙烯酸酯共軛加成而制備，產(chǎn)率較高且無副產(chǎn)物．Danossu等[6]在1970年首次報(bào)道了以雙丙烯酸酯和二胺為原料，通過邁克爾加成反應(yīng)合成線性聚氨基酯．基于一些對(duì)小型聚合物庫的初步研究，Langer課題組[7]在2003年采用半自動(dòng)化的高通量合成法，建立了包含2 350種聚氨基酯的大型聚合物庫，并進(jìn)行了篩選．

聚合物納米粒是由包含不同親水性鏈段的嵌段共聚物在水相環(huán)境中自發(fā)地組裝成為核殼結(jié)構(gòu)[8]．疏水鏈段組成內(nèi)核，能減少其與水相環(huán)境的接觸；而親水鏈段組成外殼，能幫助穩(wěn)定內(nèi)核．這樣經(jīng)過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，不僅能夠包載親水或疏水的小分子藥物，而且能夠包載蛋白質(zhì)，核酸等大分子，非常適合進(jìn)行藥物遞送[9]．近年來pH刺激響應(yīng)型納米粒在抗癌藥物的遞送方面受到越來越多的關(guān)注．這是由于腫瘤組織細(xì)胞外液的pH環(huán)境呈酸性（6.8左右），細(xì)胞內(nèi)內(nèi)涵體和溶酶體的pH為5～6，均明顯低于正常組織細(xì)胞外液的pH（約7.4）[10-12]．雖然聚氨基酯納米粒作為基因載體方面的研究已取得較大進(jìn)展[13]，但其作為pH敏感型抗癌藥物載體的研究仍鮮有報(bào)道[14-16]．本文以二胺分子和雙丙烯酸酯分子為原料，利用邁克爾加成，設(shè)計(jì)合成了一類聚氨基酯三嵌段共聚物．這類聚合物同時(shí)具有親疏水部分，在水相環(huán)境中能夠自組裝為納米粒，聚氨基酯嵌段形成一些疏水內(nèi)核可以包裹脂溶性藥物分子，PEG形成親水性外殼．另外，由于胺的氮原子在酸性環(huán)境下可被質(zhì)子化，該聚合物納米粒具有pH響應(yīng)性，有利于其在腫瘤區(qū)域的酸性環(huán)境下釋放藥物．如路線1所示．

路線1 pH響應(yīng)的聚氨基酯納米粒的形成和解散Scheme1 The formation and dissociation of nanoparticlesofpH-responsivepoly-amino ester s

通過對(duì)所合成的聚合物及其形成的納米粒的結(jié)構(gòu)、尺寸、形貌、pH敏感性質(zhì)等進(jìn)行表征，能夠初步評(píng)價(jià)其作為納米藥物載體的潛力，從而得到優(yōu)化的聚氨基酯藥物載體．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

1H NMR譜用ARX 400MHz型核磁儀（德國Bruker公司）測(cè)定，以d6-DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)；聚合物粒子的形貌采用透射電子顯微鏡（TecnaiG220S-TWIN美國FEI公司）于200 kV下觀察．聚合物粒子的粒徑和分布用ZatasizerNano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）在25℃下測(cè)量．芘熒光測(cè)試和尼羅紅熒光測(cè)試用F-280型熒光光譜儀測(cè)定．

1,6 -己二醇二丙烯酸酯（HDDA，Sigma Chem ical Co，USA）；N,N-二丁基丙二胺（DBPA，Sigma Chemical Co，USA）；氨基聚乙二醇氨基（NH2-PEG-NH2，Mn=2 000 Da，上海西寶生物科技有限公司）；芘（pyrene，Sigma Chem ical Co，USA）；尼羅紅（NR，Sigma Chem ical Co，USA）；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O，優(yōu)級(jí)純，廣東光華科技股份有限公司）；磷酸二氫鉀(KH2PO4，優(yōu)級(jí)純，天津市津科精細(xì)化工研究所）；鹽酸（HCl，分析純，含量36%～38%，北京化工廠）；乙酸（CH3COOH，分析純，北京化工廠）；透析袋（2 000/3 500DaMWCO，MYM Technologies Ltd，USA）．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚氨基酯的合成

稱取HDDA（0.497 g，2.2mmol）和DBPA（0.372g，2mmol）于10m L圓底燒瓶，并溶于2m LDMSO中．通15 min N2以置換出反應(yīng)瓶中的空氣，然后在避光、50℃恒溫油浴、磁力攪拌下反應(yīng)5 d．待此反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)瓶中加入過量的NH2-PEG-NH2，繼續(xù)在避光、50℃恒溫油浴、磁力攪拌條件下反應(yīng)5 d．反應(yīng)完成后，轉(zhuǎn)移入透析袋（3 500 Da MWCO）中，在去離子水中透析24 h，以除去溶劑DMSO、未反應(yīng)的單體及過量的NH2-PEG-NH2．將透析后的樣品冷凍干燥得淺黃色的疏松粉狀產(chǎn)物．其合成路線如路線2所示．

路線2聚合物HDDA-DBPA-PEG的合成路線Scheme2 The synthesis routeof the polymerHDDA-DBPA-PEG

另外還以不同的投料物質(zhì)的量之比合成了P1和P3聚合物．P1，P3反應(yīng)物的投料物質(zhì)的量比見表1．

表1 HDDA-DBPA-PEG反應(yīng)物投料物質(zhì)的量比Tab.1 Themolar ratiosof the reagentsof HDDA-DBPA-PEG

1.2.2 聚氨基酯納米粒的制備

取聚氨基酯樣品6mg，溶于1m LDMSO．在磁力攪拌下（900 r/m in）用注射泵向溶液中緩慢滴加2m L濃度為10mmol/L，pH為7.4的磷酸緩沖液（PB）．滴加速度設(shè)定為100L/m in，20m in加完．繼續(xù)攪拌1 h，再轉(zhuǎn)移入透析袋（2000DaMWCO）中，在pH7.4（10mmol/L）的PB中透析5 h，其間每2h換1次透析液，以除去溶劑DMSO．透析后的樣品溶液稀釋到6m L，得濃度為1mg/m L的聚合物納米粒溶液．

1.2.3 透射電鏡分析（TEM）

首先將制得的納米粒溶液滴加至含碳支持膜的銅網(wǎng)，40 s后用濾紙吸去多余的樣品，用醋酸雙氧鈾（2.0%）進(jìn)行染色，作用40 s左右，用濾紙吸去多余的染色劑，自然晾干．制樣結(jié)束后用透射電子顯微鏡進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)的觀察．

1.2.4 芘熒光測(cè)試

配制濃度為50mmol/L的不同pH梯度的磷酸緩沖溶液（phosphatebuffer，PB）：pH 9.0，pH 7.4，pH 7.0，pH 6.5，pH 5.9，pH 5.3，pH 5.0．

取聚氨基酯樣品14mg溶于7m L純水中，攪拌過夜．再與各含芘的不同pH的PB 1∶1等體積混合，攪拌4h．將攪拌好的溶液加入樣品池，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行芘的熒光激發(fā)光譜測(cè)試．設(shè)定發(fā)射波長為390nm，激發(fā)譜范圍為300～380 nm．激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm．

1.2.5 尼羅紅（NR）熒光測(cè)試

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的核磁表征

圖1為HDDA-DBPA的核磁圖，圖2為HDDA-DBPA-PEG的核磁圖，可以看出5.8～6.3 ppm處雙鍵幾乎消失，3.6 ppm處出現(xiàn)PEG峰，由此可證明HDDA-DBPAD與NH2PEGNH2共價(jià)相連．

圖1 聚合物HDDA-DBPA的核磁圖Fig.11HNMR spetrum of thepolymer HDDA-DBPA in d6-DMSO

圖2 聚合物HDDA-DBPA-PEG的核磁圖Fig.21HNMR spetrum of the polymer HDDA-DBPA-PEG in d6-DMSO

2.2聚合物納米粒的粒徑，分子量及分布

由于聚氨基酯嵌段可以形成疏水內(nèi)核，PEG形成親水性外殼，聚合物HDDA-DBPA-PEG同時(shí)具有親疏水部分，在水相環(huán)境中能夠自組裝為納米粒．納米粒的大小和分散性可用粒徑和分散系數(shù)（PDI）來表征，由電鏡可以觀察其形貌．表2為P1～P3聚合物納米粒的粒徑及分布，圖3為P1聚合物形成的納米粒．由表2和圖3可以看出，聚合物在緩沖溶液中能夠形成分散性良好的納米粒，粒徑約在30～40 nm左右．表3為用凝膠色譜儀測(cè)定的聚合物數(shù)均分子量（Mn），重均分子量（Mw）以及多分散系數(shù)（d）數(shù)據(jù)．由表3中數(shù)據(jù)可以看出，P1～P3聚氨基酯化合物的分子量均在20000以上．

圖3 聚合物納米粒的TEM圖像Fig.3 TEM imagesof thenanoparticals of the polymer

表2 HDDA-DBPA-PEG納米粒的粒徑及其分布Tab.2 The sizeand polydispersity index of the polymerHDDA-DBPA-PEG

表3 聚氨基酯化合物的分子量及其分布Tab.3 TheMolecularWeight and dispersity of thePoly-amino ester sby GPC

2.3 聚合物納米粒的pH敏感性質(zhì)

2.3.1 芘熒光測(cè)試

芘熒光測(cè)試可用于研究納米粒的pH敏感性質(zhì)．芘（Py）具有多苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，有很強(qiáng)的疏水性（在水中的溶解度為107mol/L），對(duì)環(huán)境介質(zhì)的極性變化十分敏感，因此常作為分子探針用于表征兩親性分子在水溶液中聚集狀態(tài)的改變[17]．在特定激發(fā)波長（485 nm）下，芘在水性溶液中的發(fā)射光譜有5個(gè)熒光峰值，其中第1個(gè)峰與第3個(gè)峰的強(qiáng)度比值（I338/I333）可以作為納米粒疏水性的衡量指標(biāo)．對(duì)P1～P3這3種聚合物進(jìn)行芘熒光測(cè)試，以pH為橫坐標(biāo)，I338/I333為縱坐標(biāo)作圖，得圖4．

圖4 芘的I338/I333的比值與聚合物pH的關(guān)系圖Fig.4 I338/I333ratio ofpyrenevs pH valueof thepolymer

由圖4可知，P1～P3聚合物納米粒的芘熒光測(cè)試結(jié)果類似．當(dāng)pH值低于5.5左右時(shí)，I338/I333的值未發(fā)生明顯變化．這是由于P1～P3聚合物中的叔胺基被完全質(zhì)子化，使得具有pH響應(yīng)性的聚氨基酯化合物在水相中完全溶解，沒有形成聚合物納米粒．當(dāng)pH值高于5.5左右時(shí)，叔胺基逐漸被去質(zhì)子化，I338/I333的值開始上升，聚氨基酯化合物開始形成納米粒．當(dāng)pH值達(dá)到6.2以上時(shí)，I338/I333的值又趨于穩(wěn)定，說明聚氨基酯化合物形成了較為穩(wěn)定的納米粒．

2.3.2 尼羅紅（NR）熒光探針研究納米粒在酸性條件下的解散

尼羅紅（NR）是一種獨(dú)特的中性疏水分子，熒光強(qiáng)度隨其微環(huán)境極性的增加而迅速減弱，熒光發(fā)射峰的波長紅移[18-19]；通過NR熒光強(qiáng)度的變化可以跟蹤納米粒解離的過程．因此，NR可以作為模型疏水分子來模擬藥物可控釋放過程．設(shè)定激發(fā)波長為545 nm，記錄聚合物納米粒在不同pH條件下NR的發(fā)射譜，如圖5所示．由圖5可以看到，在pH 7.4時(shí)，P1～P3納米粒的熒光強(qiáng)度最高，因?yàn)榇藭r(shí)包裹有NR的疏水性微區(qū)非常穩(wěn)定；隨著pH值的降低，NR熒光強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)最大吸收波長（max）發(fā)生紅移，這是納米粒解離使疏水微區(qū)逐漸消失的結(jié)果．同時(shí)，與pH 5.9到pH 5.0的變化相比，從pH 7.4到pH 5.9的NR熒光強(qiáng)度降低不多，max紅移也不十分明顯，說明P1～P3納米粒在pH 7.4到pH 5.9環(huán)境中比較穩(wěn)定，而在pH 5.9到pH 5.0環(huán)境中迅速解散，NR被快速釋放出來．此結(jié)果與圖4芘熒光測(cè)試結(jié)果相一致，這樣的酸敏感特性將十分有助于包載的藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中（pH5～6）可控釋放．

圖5 不同pH下NR熒光探針的發(fā)射譜Fig.5 Theem ission spectraof NR fluorescentprobe atdifferentpH

3 結(jié)論

采用邁克爾加成法合成了1種聚氨基酯三嵌段共聚物，并用其制備了pH響應(yīng)聚合物納米粒，TEM和DLS測(cè)得納米粒的粒徑在30～40 nm左右，該納米粒子分散性良好，可以在體內(nèi)通過EPR（增強(qiáng)滲透保留）效應(yīng)在腫瘤部位富集，其pH響應(yīng)性將十分有助于包載的藥物在腫瘤組織周圍（pH 6.8）以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)（pH 5）釋放．這種聚合物納米粒作為新型的pH響應(yīng)型藥物載體系統(tǒng)具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值．

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[責(zé)任編輯 田豐]

Preparation,self-assembly and disassociation propertiesof pH-responsive poly-am ino ester s

HOU Chun-yuan1，QIAO Zeng-ying2，QIAO Sheng-lin2，AN Hong-wei2，ZHAOWen-jing1，LIXiao-jun1

(1.SchoolofChemicalEngineering,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin 300130,China;2.CASKey Laboratory forBiological Effectsof Nanomaterials and Nanosafety,National Center forNanoscienceand Technology(NCNST),Beijing 100190,China)

pH-responsivepolys(-am ino ester)weresynthesized viaM ichaeladdition by using 1,6-hexanedioldiacrylate (HDDA),3-(dibutylam ino)-1-propylam ine(DBPA)and am ine-PEG-am ine(NH2-PEG-NH2,M n=2 000 Da)as reagentsw ith differentratios.The structuresofcopolymerswere confirmed by1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR).Thecopolymerscould self-assembleintomicelle-likenanoparticleswhichweremeasured by transm ission electronmicroscopy(TEM)and dynamic lightscattering(DLS),and showed that themean diametersofnanoparticles werearound 30～40nm.Themolecularweightsof the poly(-amino ester)smeasured by GPCwereallabove 20000. The dissociation behaviorsof polymeric nanoparticleswere investigated by the fluorescentmeasurements of pyreneand Nile Red,w hich proved the pH-responsive properties of the polys(-am ino ester).

poly-am ino ester s;M ichaeladdition;nanoparticles;pH-responsive;fluorescencemeasurements

O631

A

1007-2373(2015)01-0033-07

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.01.007

2014-11-03

國家自然科學(xué)基金（21304023）

侯春園（1989-），女（漢族），碩士生．通訊作者：李效軍（1967-），男（漢族），教授．

數(shù)字出版日期：2015-01-24數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20150124.0944.003.html