賈 靜（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心,廣州510530）

碳納米材料在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的研究進(jìn)展

賈 靜
（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心,廣州510530）

摘 要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是現(xiàn)代分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一，提高PCR擴(kuò)增效率具有重要意義，傳統(tǒng)方法具有眾多局限性。碳納米材料具有納米材料特殊的性質(zhì)，易與生物大分子蛋白質(zhì)、核酸相互作用，對PCR擴(kuò)增效率的提高具有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論意義。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；碳納米材料；特異性

1 引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)能夠在體外擴(kuò)增DNA，并能使微量的模板在數(shù)小時(shí)內(nèi)以指數(shù)形式擴(kuò)增數(shù)百萬倍。在實(shí)際運(yùn)用中，PCR技術(shù)還存在如假陽性、假陰性、擴(kuò)增效率低等問題。為解決上述問題，科學(xué)家們主要從三個(gè)方面進(jìn)行嘗試和努力：一是調(diào)整PCR的參數(shù)，如調(diào)整聚合酶的種類或濃度、Mg2+濃度退火溫度等；二是引入不同類型的添加劑對PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，比如甲酰胺、 二甲基亞砜、海藻糖[1-3]等；三是改進(jìn)PCR擴(kuò)增策略，如熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、降落PCR等從傳統(tǒng)PCR衍生出的策略。

碳納米材料是指分散相尺度至少有一維小于100nm的碳材料。碳納米材料按形態(tài)主要包括四種類型：片狀（石墨烯），管狀（碳納米管），纖維狀（碳納米纖維）、球狀（納米碳球） 是目前應(yīng)用非常廣泛的一類納米材料。碳納米材料能夠與生物分子發(fā)生復(fù)雜的相互作用，因此很多學(xué)者將碳納米材料引入PCR反應(yīng)中，提高PCR反應(yīng)的產(chǎn)量和特異性，拓展PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。

2 碳納米材料在PCR中的應(yīng)用

2.1 碳納米管在PCR中的應(yīng)用

2004年，Cui等[4]發(fā)現(xiàn)單壁納米碳管(SWCNTs)可優(yōu)化PCR反應(yīng)。當(dāng)PCR體系中的SWCNTs濃度低于3μg/μL時(shí)，產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。SWCNTs的作用類似Mg2+，加入SWCNTs后即使反應(yīng)液中無Mg2+，也不影響擴(kuò)增。作者推測PCR各組分和SWCNTs充分接觸后發(fā)生作用，提高PCR的反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。XPS表明PCR反應(yīng)后SWCNTs的C1s結(jié)合能增加，證實(shí)在PCR反應(yīng)中SWCNTs與DNA模板、Taq聚合酶發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用，SWCNTs與PCR各組分之間發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，SWCNTs的作用類似Mg2+，使Taq聚合酶保持高的反應(yīng)活性。

2008年，Zhang等[5]研究了單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)對于Long PCR擴(kuò)增特異性的影響。在PCR體系中添加不同管徑的SWCNTs 和MWCNTs，調(diào)節(jié)體系中碳納米管的濃度為0.8～1.6 mg/mL，擴(kuò)增長度為14.3 kb 的DNA片斷，可以提高PCR反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。作者認(rèn)為PCR效率提高是因?yàn)樘技{米管具有良好的導(dǎo)熱性，而不是與PCR組分相互作用的結(jié)果。

2.2 碳納米粉在PCR中的應(yīng)用

2007年，Zhang等[6]將納米碳粉(CNP)的懸浮液加入PCR體系，提高了多輪PCR和Long PCR的特異性。加入CNP后，在第6輪擴(kuò)增中得到單一的目標(biāo)條帶。無CNP時(shí)，第4輪擴(kuò)增開始出現(xiàn)非特異性條帶，第5輪擴(kuò)增幾乎無目標(biāo)條帶。在Long PCR中，CNP顯著減少非特異性條帶。原子力顯微鏡表明CNP與雙鏈DNA發(fā)生作用，

使引物和未完全退火的DNA結(jié)合在CNP上，阻止引物與DNA模板之間發(fā)生錯(cuò)配，減少引物二聚體的產(chǎn)生。

2.3 石墨烯在PCR中的應(yīng)用

2012年，米麗娟等[7]研究了氧化石墨烯（GO）在PCR中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)添加0.2-2.5ng/μL GO可顯著提高PCR的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)量，添加1ng/μL GO時(shí)，產(chǎn)量的提升尤為顯著，產(chǎn)率達(dá)對照組的250%。在模板來源不同、濃度不同的PCR體系中分別加入 GO，發(fā)現(xiàn)添加GO的實(shí)驗(yàn)組靈敏度提高了1-3個(gè)數(shù)量級，并顯著消除了引物二聚體，證明GO適用于各種濃度和復(fù)雜程度的DNA模板，甚至在模板量低于102拷貝數(shù)時(shí)也適用。

2012年，我們[8]研究了氧化石墨烯（GO）和還原石墨烯（rGO）對于多輪PCR反應(yīng)特異性的影響。在兩輪PCR中，GO的終濃度介于12-60μg/mL時(shí)明顯提高第一輪PCR產(chǎn)物的特異性；以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，GO在上述濃度內(nèi)無法提高PCR產(chǎn)物的特異性。然而，rGO在兩輪PCR中，終濃度為10-12μg/mL時(shí)顯著提高了PCR產(chǎn)物的特異性。此外，利用9輪PCR證實(shí)RGO對PCR特異性的影響，各輪PCR中加入12μg/mL rGO，對照組從第4輪開始已基本得不到產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)組甚至在8輪PCR反應(yīng)后依然能夠得到產(chǎn)物。還證實(shí)降低退火溫度至25℃的情況下，加入rGO的PCR體系依然得到清晰的產(chǎn)物帶。我們認(rèn)為主要是石墨烯與pfu聚合酶的相互作用，負(fù)電位較弱的rGO與pfu聚合酶形成帶正電的復(fù)合物，吸引帶負(fù)電的DNA模板和引物到rGO的表面發(fā)生退火和延伸，降低非特異性反應(yīng)的發(fā)生。

3 總結(jié)與展望

將納米材料引入PCR反應(yīng)提高了PCR反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量，拓寬了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。今后，則要嘗試解決長片段、GC富集模板等復(fù)雜體系的擴(kuò)增問題，并在RT-PCR等相關(guān)技術(shù)中促進(jìn)納米碳材料的輔助應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]G.Sarkar, et al．Nucleic Acids Res., 1990(18):7465．

[2]P.R.Winship．Nucleic Acids Res., 1989(17):1266．

[3]A.N.Spiess,et al．Clinical Chemistry,2004(50):1256-1259.

[4]D.X.Cui, et al. Nanotechnology, 2004(15):154-157．

[5]Z.Z.Zhang, et al. BioTechniques, 2008(44):537-545．

[6]Z.Z.Zhang,et al. Nanotechnology, 200(l8):355706．

[7]米麗娟等. CN102465163A, 2012-05-23.

[8]Jing Jia, et al. Small, 2012(08):2011-2015.