許珊珊　林思祖

摘要介紹了植物miRNA的作用機(jī)制，并重點(diǎn)闡述了落葉松、玉米、龍眼體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展。隨著miRNA的深入研究，體胚發(fā)生相關(guān)miRNA的功能驗(yàn)證、不同miRNA間的相互調(diào)控及對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用研究將成為重要的研究方向，因此，了解植物體胚發(fā)生miRNA的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢(shì)非常重要。

關(guān)鍵詞體細(xì)胞胚發(fā)生；miRNA；落葉松；玉米；龍眼

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-018-03

植物體細(xì)胞胚的概念源于1902年Haberlandt提出的植物細(xì)胞具有全能性，即每一個(gè)細(xì)胞都能不斷分裂，進(jìn)而分化形成完整的植株[1]。有關(guān)植物體細(xì)胞胚發(fā)生的研究最早是從胡蘿卜貯藏根組織培養(yǎng)材料中觀(guān)察到來(lái)自體細(xì)胞組織胚的啟動(dòng)和發(fā)育過(guò)程[2]。同時(shí)，由于體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程與合子胚發(fā)育高度相似[3]，且其在離體條件下可人為控制收集特定發(fā)育階段的大量材料，因此體細(xì)胞胚發(fā)生亦是研究植物胚胎發(fā)育的模式系統(tǒng)。目前，已有眾多學(xué)者對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的分子機(jī)理進(jìn)行了大量研究，并分離出許多相關(guān)基因，但由于體細(xì)胞胚發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程和基因表達(dá)[4]，且其發(fā)生過(guò)程中各階段基因激活與抑制的潛在機(jī)制尚不清楚，仍不足以闡明胚胎發(fā)生機(jī)理和解決生產(chǎn)問(wèn)題。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)為21～24 nt內(nèi)源的非編碼的小分子RNA，廣泛分布于植物基因組中。miRNA主要通過(guò)引導(dǎo)靶基因mRNA降解、介導(dǎo)翻譯抑制和介導(dǎo)DNA甲基化等途徑負(fù)向調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)[5-9]，從而調(diào)控植物細(xì)胞分裂、組織分化、器官形態(tài)建成、激素應(yīng)答與信號(hào)傳導(dǎo)以及植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答[10-16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為上層調(diào)控因子在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中同樣起著重要的調(diào)控作用[17]。筆者簡(jiǎn)要介紹了植物miRNA的作用機(jī)制，并主要從落葉松、玉米、龍眼等植物闡述體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)miRNA研究進(jìn)展。

1植物miRNA的作用機(jī)制

1.1miRNA對(duì)靶基因的剪切

miRNA 介導(dǎo)的靶基因剪切是其主要的作用形式，一般而言，miRNA對(duì)完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)的mRNA序列進(jìn)行切割。研究表明，這種切割通常精確地發(fā)生在miRAN配對(duì)堿基的第10和11位[18]。如果miRNA合成途徑中hen1、ago1、hyl1等關(guān)鍵基因發(fā)生突變會(huì)顯著降低miRNA的含量，影響其剪切作用，導(dǎo)致靶基因mRNA含量升高[19-21]；相反miRNA過(guò)表達(dá)則引起靶基因mRNA的減少。

1.2miRNA的翻譯抑制作用

在動(dòng)物中，當(dāng)RISC復(fù)合體中的單鏈miRNA與3′UTR不完全互補(bǔ)時(shí)，會(huì)通過(guò)阻斷該基因的翻譯過(guò)程，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。這種方式只影響蛋白的表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。目前，有關(guān)翻譯抑制作用的相關(guān)報(bào)道主要見(jiàn)于動(dòng)物中，而植物中的相關(guān)報(bào)道較少。研究表明，植物miR172可以影響靶基因AP2蛋白的積累，但不影響mRNA含量[22]。但最近研究表明，miR172對(duì)AP2的調(diào)控作用主要以剪切為主，只是低AP2濃度可以刺激AP2基因的表達(dá)[23]。因此，有關(guān)植物miRNA的翻譯抑制作用有待進(jìn)一步深入研究。

1.3miRNA與轉(zhuǎn)錄沉默

miRNA可通過(guò)影響DNA水平的甲基化或者組蛋白進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄[24-25]。研究表明，抗miR166的PHB基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致PHB編碼區(qū)DNA的甲基化程度降低，且只有突變PHB基因植株會(huì)受此影響，野生型則不受影響。目前，這種發(fā)生在基因編碼區(qū)3′端的甲基化模式對(duì)PHB的轉(zhuǎn)錄有何影響尚不明確[8]。

2miRNA與植物體細(xì)胞胚發(fā)生

關(guān)于miRNA在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中生物合成途徑的早期研究主要集中于比較miRNA在分化與未分化組織中的差異[26-27]。Luo等[26]從水稻分化和未分化的胚型愈傷組織中分離出31個(gè)miRNAs。其中，miR398在未分化的胚型愈傷組織中特異表達(dá)，而miR156在胚型愈傷組織從未分化狀態(tài)向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中，表達(dá)水平顯著提高。通過(guò)對(duì)它們的靶標(biāo)進(jìn)行分析得出miR398和miR156調(diào)控的靶標(biāo)分別為漆酶和SBP域結(jié)合蛋白，因此推測(cè)miRNA可能參與調(diào)節(jié)高度增殖的未分化細(xì)胞的維持，而不是朝著充分發(fā)育的體細(xì)胞胚方向分化。此外，在完全分化的體細(xì)胞胚中，胡蘿卜AGO1基因的表達(dá)隨著2，4-D的逐漸消耗表現(xiàn)出迅速上升然后又下降到幾乎檢測(cè)不到的變化規(guī)律，而AGO蛋白家族的存在對(duì)miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)是必須的，這表明在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中miRNA的合成受到嚴(yán)格的調(diào)控[27]。

目前，有關(guān)植物體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)miRNA的報(bào)道較少，僅有落葉松、龍眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等。而這些研究大都是采用高通量測(cè)序的方法來(lái)比較分析胚性與非胚性愈傷組織及體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中特異表達(dá)的miRNAs。

2.1miRNA與落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生

落葉松是針葉樹(shù)的典型代表，其在體細(xì)胞胚方面的研究領(lǐng)先于其他針葉樹(shù)種。Zhang等[28]比較了日本落葉松胚型和非胚型愈傷組織miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)共有165個(gè)miRNA有差異性表達(dá)，分別屬于4個(gè)miRNA家族。其中，在胚型愈傷組織中miR171表達(dá)上調(diào)，miR159、miR169和miR172表達(dá)下調(diào)。這4個(gè)miRNA家族都屬于非生物脅迫誘導(dǎo)，且它們所有的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子都調(diào)控與細(xì)胞分化和發(fā)育關(guān)系密切的基因，包括由miR171調(diào)控的scarecrow-like（SCL）轉(zhuǎn)錄因子、miR172調(diào)控的apetala2轉(zhuǎn)錄因子、miR159調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子和miR169調(diào)控的NF-YA轉(zhuǎn)錄因子。愈傷組織中3個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA家族同時(shí)受ABA調(diào)控，進(jìn)一步揭示了日本落葉松胚性能力轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制。在落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了87個(gè)miRNAs，29個(gè)為針葉樹(shù)特異的，來(lái)自12個(gè)家族，分別為miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、nfiR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704，而其調(diào)控的34個(gè)靶基因可能參與生長(zhǎng)發(fā)育、抗病、AGO反饋調(diào)節(jié)等多方面遺傳調(diào)控。在此過(guò)程中，72%miRNAs表達(dá)次高峰在后期單胚或早期子葉胚，在中期子葉胚最低，最高峰在后期子葉胚，分別與子葉形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活動(dòng)相吻合。miR397和miR408表達(dá)次高峰在PEMIII，而miR398在早期單胚，miRl56和miRl66在早期子葉胚，表明其與保持薄細(xì)胞壁、質(zhì)子傳遞、頂端分生組織形成等調(diào)控有關(guān)[29-30]。相應(yīng)的truncated分析表明，落葉松體胚發(fā)生過(guò)程中miRNA可以從兩端降解，66%miRNA從3′-5′降解的頻率高于5′-3′方向，且不同miRNA家族或同一家族不同成員間miRNA降解頻率不同，說(shuō)明落葉松miRNA降解受到復(fù)雜機(jī)制調(diào)控。miRNA異構(gòu)體分析表明miRNA存在3′端腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶核苷酸添加現(xiàn)象，體胚中miRNA位點(diǎn)傾向于加C；miR397a和llemiR-7在體胚發(fā)育過(guò)程中isomiR-C較豐富，說(shuō)明特異miRNA3端胞嘧啶添加在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有生物學(xué)意義[31]。

在miRNA靶基因方面，Li等[32-33]從日本落葉送體胚中成功分離了miR159的靶基因LaMYB33、miR171靶基因LaSCL6。

2.2miRNA與玉米體細(xì)胞胚發(fā)生

在玉米胚型愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中共檢測(cè)到20個(gè)差異表達(dá)miRNA保守家族，共有78個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中包括13個(gè)保守家族新成員，分別屬于zma-miR528、zma-miR172、zma-miR167、zma-miR319、zma-miR393、zma-miR396、zma-miR397和zma-miR408 8個(gè)保守miRNA家族。RT-qPCR分析結(jié)果顯示，除miR1671和miR827表達(dá)下調(diào)，其余11個(gè)miRNA均表達(dá)上調(diào)。通過(guò)降解組測(cè)序得到213個(gè)靶基因，可分為細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程3類(lèi)，分別參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫響應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)和植物代謝途徑等過(guò)程。其靶基因功能主要涉及SBP、TCP、GAMYB、ARF、F-boc和GRAS等轉(zhuǎn)錄因子。姚霞冬[34]研究表明，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與玉米胚性愈傷組織形成顯著相關(guān)，而zma-miR160、zma-miR167、zma-miR393和zma-miR394等調(diào)控的14個(gè)靶基因在該通路中表達(dá)。

2.3miRNA與龍眼體細(xì)胞胚發(fā)生

利用Solexa 測(cè)序技術(shù)從龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中得到了Unique序列6，553，782條，其中包含367個(gè)已知的龍眼miRNAs，與其他物種相比[35-38]，獲得的已知miRNAs 數(shù)量較多，說(shuō)明龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中擁有種類(lèi)豐富和數(shù)量較多的miRNA 家族。龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中sRNA 主要以24 nt 的長(zhǎng)度為主，miRNA 的表達(dá)豐度存在巨大差異，只有少數(shù)miRNA家族大量表達(dá)，絕大部分miRNA均為低豐度表達(dá)；經(jīng)過(guò)分析獲得了23 個(gè)候選的新miRNA，其中有10 個(gè)miRNA 含單個(gè)基因座，另外13 個(gè)miRNA 15 具備多個(gè)基因座。同時(shí)，鑒定得到調(diào)控DlSODs的11個(gè)dlo-miRNAs，它們以裂解DlSODs mRNA的方式調(diào)控其在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)。這11個(gè)dlo-miRNAs分別是dlo-miR156（靶標(biāo)DlCSD1a）；dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643（靶標(biāo)DlCSD1b）；dlo- miR159、398、1171a和1171b（靶標(biāo)DlCSD2a）以及dlo-miR808和2089（靶標(biāo)DlFSD1a），它們?cè)邶堁垠w胚發(fā)生過(guò)程中呈較大差異表達(dá)。龍眼體胚發(fā)生早期的形態(tài)建成主要是由dlo-miR3，5，10，12，13，156a，156c，397a，398b.1，398b.2，398b.3，808和2089*等miRNA共同介導(dǎo)的，它們均在體胚發(fā)生早期球形胚之前大量表達(dá)，晚期表達(dá)量多數(shù)下降，部分miRNA甚至不表達(dá)；dlo-miR6、160a和167a可能在龍眼體胚發(fā)生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a轉(zhuǎn)錄水平的累積對(duì)龍眼心形胚和魚(yú)雷形胚的形態(tài)建成可能是必須的；dlo-miR167a在龍眼子葉胚和成熟胚中起主要作用；而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)均較穩(wěn)定。這說(shuō)明miRNAs表達(dá)的組織和時(shí)空特異性共同介導(dǎo)了龍眼體胚的發(fā)生[39-40]。

利用RT-PCR技術(shù)，從龍眼胚性愈傷組織中獲得了4條miRNA的初級(jí)體序列，分別命名為dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a，大小分別為254、751、560、228 bp。生物信息學(xué)分析表明，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a均含有miRNA典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且它們二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能遠(yuǎn)高于一般植物的平均自由能；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR397a與擬南芥同源性很高，dlo-pri-miR166a與甜橙有很高同源性；此外，利用psRNA Target 程序預(yù)測(cè)出miR156a-1、miR156a-2、miR166a、miR397a靶基因[41]。

對(duì)龍眼體胚進(jìn)行外源激素及非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)dlo-miR156a、dlo-miR397a及其靶基因dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6均有不同的表達(dá)模式，而dlo-miR166a在整個(gè)外源激素及非生物脅迫處理過(guò)程中均未表達(dá)。dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a初級(jí)體超表達(dá)研究表明，成熟dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a表達(dá)量均增加，且對(duì)于不同長(zhǎng)度dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2，成熟dlo-miR156a表達(dá)量也有很大差異[41]。

3展望

植物體細(xì)胞胚作為研究植物胚胎發(fā)育的模式系統(tǒng)，其發(fā)生機(jī)理一直是研究熱點(diǎn)。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控因子在植物體胚發(fā)生過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。目前有關(guān)植物體胚 miRNA調(diào)控作用的報(bào)道較少，僅有落葉松、龍眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等，但這些研究也僅限于體胚miRNA 的分離與鑒定，未對(duì)miRNA在體胚發(fā)生過(guò)程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)研究。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)體胚發(fā)生相關(guān)miRNA的功能驗(yàn)證、不同miRNA間的相互調(diào)控及對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用研究，將有助于進(jìn)一步闡明miRNA在植物體胚發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

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