李青苗　郭俊霞　王曉宇等

摘要

[目的]通過對優(yōu)選菌種長勢較好的7株子實體組織分離后再培養(yǎng)，研究子實體生長情況，為北蟲草菌種的復壯技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。[方法]從子實體性狀、產(chǎn)量及蟲草多糖含量測定等方面進行比較研究。[結(jié)果]子實體顏色均為金黃色，可以保持母種的顏色性狀；除C1-柄分離后，子實體的長相纖細，與母種長相粗壯有差異外，其他菌株頭柄分離后子實體長相均可以保持母種的長相性狀；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分離菌株子實體的最大長度均高于母種；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分離子實體的產(chǎn)量均高于母種；各菌株不同分離部位組織分離后再培養(yǎng)子實體多糖含量與母種的多糖含量無明顯差異。[結(jié)論]組織分離可作為獲得北蟲草優(yōu)質(zhì)菌種的有效方法之一。

關(guān)鍵詞 北蟲草； 組織分離；子實體

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-003-02

Study on Growth Status of Cordyceps militaris Tissue Isolation Fruiting Body

LI Qingmiao， GUO Junxia*， WANG Xiaoyu et al

（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu， Sichuan 610041）

Abstract [Objective] To study status of Cordyceps militaris tissue isolation fruiting body growth， provide certain theory basis for the rejuvenation technology of Cordyceps militaris. [Method] The fruiting body traits， yield， Cordyceps polysaccharide content and other aspects were comparatively studied. [Result] Fruiting bodies are golden yellow color， can keep mother character； fruiting body appearance， can keep mother species character except C1 handle， the longest length of strain was isolated from the fruiting body， except the C3handle， C5handle， C6handle， the maximum length of the other strains were higher than the mother species； the yield of fruiting body were higher than the mother species except C3， C5， C6handle； No significant difference of polysaccharide content between the fruiting body and the mother species. [Conclusion] Tissue isolation method can be used as an effective method to obtain high quality strains of Cordyceps militaris.

Key words Cordyceps militaris； Tissue isolation； Fruiting body

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris（L.ex Fr.）link）簡稱北蟲草，又名蛹蟲草，屬子囊菌亞門核菌綱球殼菌目麥角菌科蟲草屬真菌，是蟲草屬的模式種，是同冬蟲夏草極為相近的一個種，屬藥食兩用真菌類[1]。經(jīng)研究證實，其化學成分與冬蟲夏草相近，含有蟲草素、蟲草酸、氧化物歧化酶（SOD）等生物活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素，與天然冬蟲夏草有相似的醫(yī)療保健功效[1]，是冬蟲夏草的理想替代品。蟲草中的各種活性成分具有不同的功效。蟲草氨基酸是蟲草補益強壯作用和增強免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[2]；多糖及核苷酸類的有效成分能夠抗腫瘤、保護肝臟、延緩衰老[3]；蟲草酸可以預防血栓的形成， 對各種類型的肺部疾病和支氣管哮喘也有很好的療效；蟲草素作為細胞毒性物質(zhì)具有增強免疫力、抗腫瘤等藥理作用。

目前，北蟲草的人工培育及其產(chǎn)業(yè)化研究成為國內(nèi)外研究的熱點，而優(yōu)良菌種是提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量的前提條件。組織分離是通過食用菌子實體的部分組織來獲得純菌種的技術(shù)[4]。研究證實，采取組織分離法所獲得的純培養(yǎng)遺傳性狀穩(wěn)定、變異小，是獲得優(yōu)良菌種的一種有效、簡便的方法。通過對優(yōu)選菌種長勢較好的子實體組織分離再培養(yǎng)后，從子實體性狀、產(chǎn)量及蟲草多糖含量測定等方面，對組織分離子實體遺傳性狀的穩(wěn)定性進行分析，同時從培養(yǎng)后的子實體中優(yōu)選優(yōu)質(zhì)菌株，對母種進行復壯，為北蟲草的工廠化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

前期試驗優(yōu)選菌種長勢較好的子實體有C1～C7菌株。主要試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

栽培培養(yǎng)基。組成為：大米40 g，2%葡萄糖，0.2% KH2PO4，0.1%MgSO4，1.5%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.05%復合微生素B。

1.2.2

接種方法。

將組織分離菌絲發(fā)菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接于大米栽培培養(yǎng)基中，每罐頭瓶接種量為2 cm2，各菌株轉(zhuǎn)接10瓶。在菌絲培養(yǎng)階段，溫度20 ℃，濕度65%，暗培養(yǎng)；待菌絲長滿基后即轉(zhuǎn)入室內(nèi)，自然光照，在溫度19 ℃、濕度65%條件下轉(zhuǎn)色；在溫度22 ℃、濕度80%條件下催蕾，子實體生長；待子實體產(chǎn)生尖端膨大，有細粉狀孢子形成時采收。

1.2.3

子實體多糖含量的測定。采用硫酸-苯酚法[5]，測定子實體多糖含量。

1.2.3.1

葡萄糖標準曲線。

精確稱取105 ℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置于100 ml容量瓶中，定容，搖勻。取1 ml 溶液定容于25 ml 容量瓶中，搖勻，備用。

分別吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 ml，用蒸餾水補充至2 ml，加入濃度5%苯酚溶液1 ml，靜置10 min，搖勻，室溫下放置20 min，在490 nm處測定吸光度值（以2.0 ml蒸餾水為空白），得到回歸方程為：A=6.476 3C-0.044 7（R=0.999 2）。

式中，A為吸光度；C為葡萄糖含量。

1.2.3.2

樣品處理方法。將

子實體干燥樣品打粉，精確稱樣0.5 g，索氏抽提4 h，向抽提液中加活性碳脫色，過濾，80 ℃水浴濃縮至一定體積，加無水乙醇配制成濃度80%乙醇液，冰箱靜置12 h， 過濾，用濃度80%乙醇50 ml 洗滌。將沉淀溶解于80 ml熱水中，冷卻，采取Sevag法反復5次去蛋白，于水浴上揮去有機相。最后，移入50 ml容量瓶中，冷卻，定容，備用。

1.2.3.3

測定。

精密吸取樣品處理液2.0 ml，置于10 ml比色管中?？瞻孜?.0 ml蒸餾水，置于10 ml比色管中。向樣品管和空白管中加入濃度5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速加濃硫酸5.0 ml，搖勻，放置5 min，然后置于沸水浴中加熱1

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株不同分離部位組織分離后子實體生長情況

由表1、表2可知，在不同菌株頭柄組織分離后，其子實體顏色均為金黃色，都可以保持母種的顏色性狀；除C1-柄分離后，子實體的長相纖細，與母種長相粗壯有差異外，其他菌株頭柄分離后子實體長相均可以保持母種的長相性狀；與母種菌株長度相比，各分離菌株最大長度C1-頭、柄分別增長1.2、0.8 cm，C2-頭、柄分別增長0.8、1.0 cm，C3-頭、柄分別增長0.1、-0.2、C4-頭、柄分別增長0.7、1.3 cm，C5-頭、柄分別增長0.8、-0.4 cm、C6-頭、柄分別增長-0.6、-2.0 cm，C7-頭、柄分別增長2.7、1.1 cm。除C3-柄、C5-柄、C6-頭、柄外，其他分離菌株子實體的長度均高于母種。由此可知，北蟲草菌株經(jīng)組織分離后再培養(yǎng)子實體可保持母種顏色、長相性狀，分離后所有子實體中的最大長度比母種子實體的長度長2.7 cm。所以，從北蟲草組織分離后代

2.2 各菌株不同分離部位組織分離后子實體每瓶平均產(chǎn)量

由圖1可知，各菌株子實體不同部位組織分離后再培養(yǎng)子實體的每瓶平均產(chǎn)量不同。與母種子實體產(chǎn)量相比，除C3-柄、C4-柄、C6-頭、柄外，其他分離菌株子實體的每瓶產(chǎn)

量均高于母種。

2.3 各菌株不同分離部位組織分離后子實體多糖含量

經(jīng)測定，母種、C1-頭、C1-柄、C2-頭、C2-柄、C3-頭、C3-柄、C4-頭、C4-柄、C5-頭、C5-柄、C6-頭、C6-柄、C7-頭、C7-柄多糖含量分別為2.7%、2.4%、2.4%、28%、28%、2.4%、2.4%、2.5%、2.5%、2.6%、2.6%、2.3%、23%、2.8%、2.8%。可見，

各菌株不同分離部位組織分離后再培養(yǎng)子實體多糖含量與母種的多糖含量無明顯差異。北蟲草子實體組織分離后仍可保持母種的原有質(zhì)量。

3 討論

通過對原菌種菌株子實體組織分離后再培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)子實體顏色均為金黃色，都可以保持母種的顏色性狀；除C1-柄分離后，子實體的長相纖細，與母種長相粗壯有差異外，其他菌株頭柄分離后子實體長相均可以保持母種的長相性狀；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分離菌株子實體的長度均高于母種；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分離子實體的產(chǎn)量均高于母種；各菌株不同分離部位組織分離后再培養(yǎng)子實體多糖含量與母種的多糖含量無明顯差異。北蟲草子實體組織分離后仍可保持母種的原有質(zhì)量。

由此可知，北蟲草子實體組織分離后再培養(yǎng)可保持母種的優(yōu)良性狀和質(zhì)量的穩(wěn)定性，且產(chǎn)量有所增加。組織分離可以作為獲得北蟲草優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的有效方法之一。

參考文獻

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[3] 劉東穎.冬蟲夏草誘導乳癌細胞MCF7凋亡的實驗研究[J].河北中醫(yī)，2007，29（1）：66.

[4] 黃年來.中國食用菌百科[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：176- 177.

[5] 魯曉巖.硫酸―苯酚法測定北冬蟲夏草多糖含量[J].食品工業(yè)科技，2002，23（4）：69-70.