劉 鼎，李中堅(jiān)，雷樂成

（浙江大學(xué) 生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310027）

生物陰極是指微生物電化學(xué)系統(tǒng)中，附著有生物膜并能將電子傳遞給微生物進(jìn)行一系列生物電化學(xué)反應(yīng)的電極［1］.由于其在污水處理［2］、生物合成［3］以及生物固碳［4］等領(lǐng)域均有著潛在的應(yīng)用價(jià)值，受到了越來越多學(xué)者的關(guān)注.

在生物陰極研究中，用于接種的污泥一般取自生活污水處理廠或污染源現(xiàn)場水樣［5］.為了使微生物電化學(xué)系統(tǒng)達(dá)到較高的運(yùn)行效果，需要對(duì)接種的細(xì)菌進(jìn)行一系列的篩選與馴化［6-8］.目前，大多數(shù)學(xué)者利用微生物燃料電池或微生物三電極體系對(duì)菌種進(jìn)行篩選及馴化，通過給工作電極施加負(fù)電勢，促進(jìn)電化學(xué)活性細(xì)菌（electrochemically active bacteria，EAB）在電極表面大量富集［9-11］.然而，在篩選與馴化用于高效去除難降解有機(jī)污染物的EAB時(shí)，污染物對(duì)細(xì)菌具有毒性，會(huì)抑制細(xì)菌的新陳代謝活動(dòng)，從而影響電化學(xué)篩選與馴化效果.

本文對(duì)原始污泥依次進(jìn)行污染物定向富集、親氫氣自養(yǎng)菌梯度篩選微生物三電極體系馴化，建立一套適用于難降解有機(jī)污染物處理的生物陰極構(gòu)建方法.在此基礎(chǔ)上，分析五氯酚（pentachlorophenol，PCP）的初始質(zhì)量濃度、氧化還原介體以及pH 值對(duì)生物陰極運(yùn)行性能的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用血清瓶（125 mL）、頂空鋁蓋（直徑20mm）、封口器等購于杭州米克化工有限公司.丁基膠塞購于美國Chemglass 公司，型號(hào)為CLS-4209-14.工作電極為高純石墨塊電極（5cm×3cm×1cm，純度為99.99%，北京吉興盛安工貿(mào)有限公司）.對(duì)電極為直徑0.6cm，長20cm 的高純石墨棒（純度為99.99%，北京吉興盛安工貿(mào)有限公司）.參比電極為上海精密科學(xué)儀器有限公司232-01型飽和甘汞電極（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氫電極電勢為＋240 mV，本文所有電勢均指相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氫電極電勢）.實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)子交換膜為NafionTM117 質(zhì)子交換膜（美國Dupont公司）.

1.2 反應(yīng)裝置

實(shí)驗(yàn)所使用的反應(yīng)器為雙室反應(yīng)器，由2個(gè)對(duì)稱的玻璃反應(yīng)器組成，每個(gè)反應(yīng)器的有效容積為340mL.反應(yīng)器外層由玻璃夾套包裹，實(shí)驗(yàn)過程中，循環(huán)泵入恒溫蒸餾水，以保證反應(yīng)器內(nèi)營養(yǎng)液溫度恒定.工作電極室與對(duì)電極室相連處通過質(zhì)子交換膜阻隔，其橫截面積為15.9cm2.質(zhì)子交換膜在使用前參照Liu等［12］的報(bào)道進(jìn)行預(yù)處理.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及營養(yǎng)液組成

親氫氣自養(yǎng)菌篩選及EAB 馴化過程采用厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其組成如表1所示.其中，對(duì)電極室內(nèi)的厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液不添加微量金屬元素溶液和維生素溶液.

表1 每升厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組成（pH＝7.0）Tab.1 Components of anaerobic basal medium per liter（pH＝7.0）

1.4 親氫氣自養(yǎng)菌篩選方法

用于篩選親氫氣自養(yǎng)菌的菌種來自實(shí)驗(yàn)室厭氧／好氧生物流化床中的厭氧室，該反應(yīng)器內(nèi)污泥取自杭州市四堡污水處理廠厭氧工藝段，具體篩選步驟如下.

1）將28mL 厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液分裝至3 組平行的血清瓶中，并分別投加0.04 mg PCP，取2 mL PCP降解菌富集菌液加入到血清瓶中，蓋緊膠塞后用頂空鋁蓋加以密封.

2）通入N2／CO2混合氣（體積比為80∶20）30min.之后，充入高純氫氣，使瓶內(nèi)氫氣分壓達(dá)到0.2 MPa.

3）每隔12h，取0.5mL樣品，測試PCP的質(zhì)量濃度ρPCP.當(dāng)PCP被完全降解時(shí)，取出10 mL 血清瓶中營養(yǎng)液，并添加10mL新配制的營養(yǎng)液.

4）更替營養(yǎng)液時(shí)，采用梯度投加的方式逐級(jí)遞增PCP的投加量.

1.5 電化學(xué)活性細(xì)菌的馴化

EAB的馴化在微生物三電極體系中進(jìn)行.接種前，先取335mL含有PCP的厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加到反應(yīng)器的工作電極室中，通入N2／CO2混合氣30min.之后，將用于去除PCP 的親氫氣自養(yǎng)菌進(jìn)行稀釋，使OD600值（微生物懸濁液在600nm 處的吸光度，用以衡量微生物濃度的常規(guī)指標(biāo)）達(dá)到0.6.取5mL稀釋后的菌液加入到反應(yīng)器中.

采用計(jì)時(shí)電流法（chronoamperometry，CA）對(duì)EAB進(jìn)行馴化，電極電勢控制在-0.2V，每隔10min記錄一次電流值.每隔12h對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的PCP質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，之后對(duì)PCP質(zhì)量濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其維持在20mg／L的水平.當(dāng)工作電極的電流達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，將電極表面的生物膜刮入離心管中，并利用厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)液定容到5mL，重新啟動(dòng)掛膜.所有反應(yīng)器均以鋁箔包裹.實(shí)驗(yàn)過程中，持續(xù)向反應(yīng)器中通入N2／CO2混合氣，控制溫度在30℃.馴化結(jié)束后，對(duì)電極進(jìn)行循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）掃描，掃描電勢范圍為-0.56～1.04V，掃描速率為5mV／s.

為比較篩選方法的效果，分別取厭氧／好氧生物流化床厭氧室內(nèi)污泥以及經(jīng)LB液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行接種，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn).

1.6 分析方法

采集的樣品先經(jīng)過高速離心（10 000r／min）處理，通過0.22μm 濾膜對(duì)離心處理后的上清液進(jìn)行過濾，取濾液進(jìn)行分析.

PCP 質(zhì)量濃度利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn) 行 測定.氯離子濃度利用離子色譜（ion chromatography，IC，Dionex ICS-1100）進(jìn)行分析.總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）利 用 總 有 機(jī) 碳 分 析 儀（Shimadzu TOC-VCPH）直接測定.

庫侖效率（coulombic efficiency，CE）在本研究中是指參與還原PCP 的電荷數(shù)與外電路傳遞的電荷數(shù)的比值，計(jì)算公式為

式中：VC為工作電極室的有效容積（340mL）；F 為法 拉 第 常 數(shù)（Faraday's constant，96485 C／mol e-）；b表示每脫去一個(gè)氯原子所需要的電子數(shù)（1 mol e-／mol Cl-）；△ρCl表示實(shí)驗(yàn)前后Cl-質(zhì)量濃度的增加量；M 為Cl-的相對(duì)質(zhì)量（35.5g／mol）；Q 為總電量，即電流對(duì)運(yùn)行時(shí)間的積分.

2 結(jié)果與討論

2.1 親氫氣自養(yǎng)菌的篩選

難降解有機(jī)污染物對(duì)微生物往往具有一定的毒害作用，因此在篩選親氫氣自養(yǎng)菌的過程中，采用污染物梯度投加的方式，即在確保其它條件不變的情況下，開始先投加低濃度的PCP，待微生物適應(yīng)這一濃度范圍后再逐步提高PCP的投加量.

如圖1所示為高效去除PCP 的親氫氣自養(yǎng)菌篩選過程.經(jīng)過17個(gè)周期的連續(xù)篩選，菌液對(duì)PCP的去除速率由開始時(shí)的0.30±0.02mg／（L·d）上升到2.12±0.05mg／（L·d），親氫氣自養(yǎng)菌在血清瓶內(nèi)不斷富集.從篩選過程來看，PCP 對(duì)微生物具有一定的毒性，當(dāng)PCP初始質(zhì)量濃度由7mg／L 上升到14mg／L時(shí)，去除速率迅速從1.90±0.07mg／（L·d）下降至0.11±0.03 mg／（L·d），經(jīng)過7天的培養(yǎng)后，其去除速率才逐漸恢復(fù)到1.86±0.13 mg／（L·d）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：經(jīng)過一段時(shí)間的定向篩選，親氫氣自養(yǎng)菌得到了富集，并可在有機(jī)碳源匱乏的環(huán)境中利用氫氣作為電子和能量來源驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列的代謝過程.盡管經(jīng)過篩選后的菌種對(duì)PCP具有較強(qiáng)的去除效果，PCP對(duì)微生物仍舊具有一定的毒害作用.通過連續(xù)的篩選，具有高效降解PCP酶系的微生物得以在體系中保留，并將這一性狀傳遞給子代細(xì)菌，從而表現(xiàn)為血清瓶內(nèi)的菌種逐漸適應(yīng)高濃度的PCP溶液，并且PCP去除速率不斷提升.

圖1 高效去除五氯酚的親氫氣自養(yǎng)菌篩選過程Fig.1 Procedure of hydrogenophilic autotrophic bacteria screening for efficient removal of PCP

2.2 電化學(xué)活性細(xì)菌的馴化

如圖2所示為高效去除PCP的EAB的馴化過程.微生物的生長經(jīng)過了適應(yīng)期、增長期和穩(wěn)定期3個(gè)階段.隨著馴化周期的推進(jìn)，EAB的適應(yīng)期從9d減少到了3d，穩(wěn)定期電流密度J 從-25mA／m2左右增長到-31mA／m2左右.圖中，反應(yīng)器電流密度在第3個(gè)馴化周期的后期出現(xiàn)了明顯的波動(dòng).這主要是由于在馴化過程進(jìn)行到后期時(shí)，對(duì)N2／CO2混合氣進(jìn)行了更換.在這一過程中，由于進(jìn)氣量發(fā)生了波動(dòng)，從而導(dǎo)致體系中電流密度發(fā)生明顯的波動(dòng).此外，電流密度的波動(dòng)也有可能是由于觸碰到了電化學(xué)工作站連接線.由于石墨棒電極相對(duì)較粗，輕微的觸碰可能導(dǎo)致鱷魚夾與電極間接觸電阻發(fā)生變化，導(dǎo)致電流密度的突然波動(dòng).

圖2 高效去除五氯酚的電化學(xué)活性細(xì)菌馴化過程中電流密度的變化Fig.2 Change of current densities during acclimation of electrochemically active bacteria for efficient removal of PCP

通過對(duì)CV 圖譜（見圖3）的分析可以發(fā)現(xiàn)，與馴化開始前以及未接種細(xì)菌的對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，在經(jīng)過馴化后的生物陰極CV 圖的0.3V 處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的氧化還原峰.這說明EAB的存在使得電極具有對(duì)PCP的還原能力.值得注意的是，在-400mV電勢下生物陰極的電流量低于馴化前和非生物陰極馴化后的電流量，造成這一現(xiàn)象的原因可能是：1）石墨塊電極板與石墨棒接觸處通過碳導(dǎo)電膠相粘，因此不同電極間的電阻值有一定的差異.2）生物陰極表面覆蓋有一層EAB，減少了電極與電解液的接觸面積，因此在生物陰極上，質(zhì)子的電化學(xué)還原速率相較于非生物陰極要慢.3）盡管EAB可催化電化學(xué)產(chǎn)氫反應(yīng)，但是循環(huán)伏安掃描時(shí)間較短（在負(fù)電勢條件下共持續(xù)23s），微生物沒有足夠的時(shí)間適應(yīng)電勢條件的改變，因此生物陰極對(duì)電化學(xué)產(chǎn)氫的促進(jìn)作用不明顯.

為了比較本研究中EAB 的篩選與馴化方法與傳統(tǒng)方法的差異，特設(shè)立了2組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照.如圖2所示，以厭氧／好氧生物流化床內(nèi)厭氧室內(nèi)的污泥以及LB 液體培養(yǎng)基富集菌液作為接種源，分別代表三電極體系直接馴化及先篩選后電化學(xué)馴化的方法.經(jīng)過前期含有PCP的LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后，接種液中的細(xì)菌比厭氧／好氧生物流化床內(nèi)厭氧室的細(xì)菌對(duì)高濃度PCP溶液具有更好的適應(yīng)性，其電流密度的上升速度為后者的2.0～3.0倍.然而，其掛膜所需的時(shí)間遠(yuǎn)超過本實(shí)驗(yàn)的篩選方法（接種14d后仍然未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)），其最終的電流密度僅為本實(shí)驗(yàn)篩選方法的1／7.

圖3 用于處理五氯酚的電化學(xué)活性細(xì)菌馴化不同階段的循環(huán)伏安圖譜Fig.3 Cyclic voltammograms at different stages of electrochemically active bacteria acclimation

在電化學(xué)馴化之前引入親氫氣自養(yǎng)菌的篩選過程，能夠有效地從PCP高效降解菌中篩選出潛在的以電極作為電子供體的菌種.因此，當(dāng)把經(jīng)過篩選后的親氫氣自養(yǎng)菌接種到反應(yīng)器后，菌種能夠較快速地適應(yīng)電化學(xué)馴化體系.另外，前期的篩選排除了電化學(xué)馴化過程中雜菌對(duì)EAB 的干擾，為EAB 在電極表面的附著提供了更多的空間，大幅縮短了電化學(xué)馴化所需要的時(shí)間，提高了生物陰極的性能.

2.3 五氯酚的初始濃度對(duì)生物陰極去除五氯酚的影響

當(dāng)電極電勢為-400 mV 時(shí)，生物陰極對(duì)PCP的去除能達(dá)到較高水平，且此時(shí)的能量利用效率最高［13］.當(dāng)電極電勢在-400mV 以下時(shí)，電極表面會(huì)發(fā)生產(chǎn)氫反應(yīng)，庫侖效率大幅下降［14-16］.這一副反應(yīng)降低了生物陰極的能量利用效率，不利于工程上的實(shí)際應(yīng)用.因此，所有實(shí)驗(yàn)都在電極電勢小于-400mV的條件下進(jìn)行.

通過對(duì)PCP初始質(zhì)量濃度ρ0（PCP）的分析可以發(fā)現(xiàn)，生物陰極對(duì)PCP的去除率（RPCP＝△ρ／ρ0（PCP））以及脫氯速率（RCl＝△ρCl／△t）隨著PCP 初始質(zhì)量濃度的升高（由10mg／L上升到20 mg／L）而增加.但是，當(dāng)PCP初始質(zhì)量濃度進(jìn)一步由20mg／L上升到40mg／L時(shí)，生物陰極對(duì)PCP的去除能力迅速下降（見圖4）.這是由于高濃度的PCP溶液對(duì)EAB具有一定的毒性，而電化學(xué)還原作用對(duì)PCP的去除效果有限，繼續(xù)增加PCP 的初始濃度，會(huì)使得其在溶液中大量富集.

與非生物陰極相比，生物陰極具有對(duì)PCP更強(qiáng)的去除能力，當(dāng)ρ0（PCP）＝20mg／L時(shí)，生物陰極對(duì)PCP的去除率為非生物陰極的3 倍，對(duì)TOC 的去除率（RTOC＝△T／T0）為非生物陰極的2.7倍，脫氯速率為非生物陰極的5.4倍.由此可見，生物陰極上的EAB能夠利用電極作為電子供體，催化PCP 的高效降解.值得注意的是，相較于非生物陰極，利用生物陰極處理PCP 時(shí)，電極具有更高的庫侖效率.這說明，生物陰極可以催化電子由電極向PCP的定向轉(zhuǎn)移，從而加速對(duì)PCP的還原脫氯.然而，生物陰極對(duì)于PCP脫氯產(chǎn)物的礦化效果一般，在所有經(jīng)過還原后的PCP 脫氯產(chǎn)物中，只有20%左右的中間產(chǎn)物被完全礦化.EAB 對(duì)PCP 的礦化不再屬于生物電化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)速率受限于微生物體內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)，因此，TOC 去除率與五氯酚去除率及庫侖效率之間存在一定的差異.

2.4 氧化還原介體對(duì)生物陰極去除五氯酚的影響

如圖5 所示為不同蒽醌-2，6-磺酸鈉（anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）濃度（cAQDS）下，生物陰極及非生物陰極中的PCP 去除率、脫氯速率、TOC去除率以及庫侖效率.在非生物陰極反應(yīng)器中，AQDS對(duì)PCP 的去除率沒有任何影響，說明AQDS不能直接將電子轉(zhuǎn)移給PCP.當(dāng)AQDS濃度增加時(shí)，非生物陰極中庫侖效率隨之下降，這說明AQDS與PCP在電極表面存在著競爭電子的關(guān)系.在生物陰極中，盡管庫侖效率隨著AQDS濃度的增加而下降，但是其對(duì)PCP和TOC的去除率均有一定的提升.

圖4 五氯酚初始濃度對(duì)生物陰極性能的影響Fig.4 Effects of initial PCP concentration on the performance of biocathode

圖5 蒽醌-2，6-磺酸鈉濃度對(duì)生物陰極性能的影響Fig.5 Effects of AQDS concentration on the performance of biocathode

對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行前后溶液中的生物量進(jìn)行測試，當(dāng)添加0.01 mM 的AQDS 時(shí)反應(yīng)器中殘余液的OD600值（0.147）較未添加AQDS時(shí)反應(yīng)器中殘余液的OD600值（0.025）有了顯著提升.由于AQDS可作為氧化還原電子介體，當(dāng)將其添加進(jìn)反應(yīng)器后，一部分利用外源電子介體作為電子供體的EAB 不再需要附著在電極上與其它細(xì)菌競爭空間，而是在溶液中懸浮生長，并可通過AQDS的介導(dǎo)，間接地利用外電路電子進(jìn)行一系列的代謝及PCP 降解反應(yīng).

2.5 pH 值對(duì)生物陰極去除五氯酚的影響

PCP的還原脫氯除了需要外源電子供體，還需要有質(zhì)子的參與，其反應(yīng)式如下：

因此，pH 值對(duì)于生物陰極中PCP 的去除率具有一定的影響.如圖6所示，當(dāng)pH 值由8.0下降至5.5時(shí)，非生物陰極對(duì)PCP的去除效果不斷增強(qiáng)，即較低的pH 值有利于PCP的電化學(xué)還原.在生物陰極中，當(dāng)pH 值由8.0下降到6.5時(shí)，PCP去除率逐漸增高，在pH＝6.5的條件下，生物陰極對(duì)PCP的去除效果達(dá)到最佳（89.66±3.66%）.然而，繼續(xù)降低pH 值，生物陰極對(duì)PCP 的去除率卻迅速下降，說明當(dāng)pH 值低于6.0時(shí)會(huì)對(duì)電化學(xué)活性細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用.這一結(jié)果與傳統(tǒng)生化處理方法中PCP降解菌最適的pH 范圍（6.0～7.0）一致［17］.

圖6 pH 值對(duì)生物陰極性能的影響Fig.6 Effects of pH on performance of biocathode

3 結(jié) 論

（1）本研究建立了一套用于篩選與馴化處理難降解有機(jī)污染物的EAB方法，大幅縮短了生物陰極的掛膜時(shí)間，并有利于提高生物陰極的運(yùn)行性能.與傳統(tǒng)的直接電化學(xué)篩選與馴化方法相比，該方法將生物陰極構(gòu)建時(shí)間由超過14d縮短到3d，且電流密度較傳統(tǒng)方法提高了6倍.

（2）生物陰極可以有效去除PCP，最適的PCP初始質(zhì)量濃度為20mg／L，當(dāng)初始質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg／L及以上時(shí)，會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用.AQDS能促進(jìn)EAB 的懸浮生長，間接參與PCP 的降解.pH 值越低越有利于PCP 的還原脫氯，但較低的pH 值會(huì)抑制EAB的活性，最適pH 值為6.5.當(dāng)電極電勢為-400 mV，PCP 初始質(zhì)量濃度為20 mg／L，pH 值為6.5，且無氧化還原介體時(shí)，反應(yīng)器運(yùn)行100h后的PCP去除率為89.66±3.66%，TOC 去除率為17.24±3.03%.

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