余燕，何素婷，王自強(qiáng)，鄧鋒Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180；2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

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實(shí)時熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測肝水解肽樣品中牛、豬源性成分的對比研究

余燕1，何素婷2，王自強(qiáng)2，鄧鋒1Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180；2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

目的 對比實(shí)時熒光定量PCR與常規(guī)PCR檢測肝水解肽樣品中牛、豬源性成分的有效性。方法 對牛、豬源性肝水解肽樣品肝臟至上清液工藝段樣品進(jìn)行DNA提取，采用實(shí)時熒光定量PCR和常規(guī)PCR同時檢測樣品中的DNA。結(jié)果 實(shí)時熒光定量PCR和常規(guī)PCR在豬源、牛源肝水解肽從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中，均檢測到動物源性DNA，在上清液至超濾液四中，均未檢測出動物源性DNA。結(jié)論 兩種方法均可用在檢測肝水解肽樣品中牛、豬源性成分。實(shí)時熒光定量PCR同時還具有快速、簡便、不污染環(huán)境、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可明顯提高工作質(zhì)量及效率。

肝水解肽；熒光定量PCR；常規(guī)PCR；牛源性成分；豬源性成分

肝水解肽(heparolysate)是由牛或豬的肝臟經(jīng)酶類水解提取的低分子量多肽類物質(zhì)，含有多肽類、氨基酸類、核酸類等物質(zhì)[1]，促進(jìn)正常肝細(xì)胞的增殖和再生，對四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，促進(jìn)病變組織恢復(fù)[2]，用于慢性肝炎、肝硬化等疾病的輔助治療[3]。鑒于瘋牛病和羊瘙癢病的確診，凡是動物組織來源的藥品均被列于高風(fēng)險品種。由于歷史原因，質(zhì)量控制基本靠成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原料及中間產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝基本沒有質(zhì)量要求。該制劑生產(chǎn)廠家多，各廠家的生產(chǎn)工藝均不盡相同：如肝臟來源、水解酶的種類、水解條件、水解程度及超濾處理等。建立一個能鑒別真?zhèn)巍⒃u價優(yōu)劣，監(jiān)控質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵。目前，有關(guān)動物源性成分的檢測方法包括形態(tài)學(xué)分類方法、細(xì)胞學(xué)鑒定方法、生物化學(xué)鑒定方法及分子生物學(xué)方法等[4]。分子生物學(xué)中的PCR方法因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，而成為商品中動物源性材質(zhì)鑒別的有效方法[5]，并在保健品、藥品、飼料、食品中的鑒定研究中得到廣泛應(yīng)用[6-12]。本研究擬采用熒光定量PCR與常規(guī)PCR來鑒別肝水解肽從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中的動物源性，通過比較2種方法檢測肝水解肽樣品的有效性，以評價實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定生化藥物動物源性的價值。

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultrospec 2100 核酸蛋白快速測定儀(購自美國GE公司)；Gene Amp? PCR System 9700 核酸擴(kuò)增儀(購自美國AB公司)；Bio-rad DNA凝膠電泳儀(購自美國Bio-rad公司)；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(購自美國Bio-rad公司)；Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system(購自美國AB公司)。

1.2 試劑 檢測試劑盒Real Time PCR Porcine DNA Detection Kit、Real time PCR bovine DNA Detection kit(購自大連寶生物工程有限公司)。Premix Taq擴(kuò)增反應(yīng)液(購自Takara 公司)；提取試劑盒分別為DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products(購自Takara公司)。Mnl I核酸限制性內(nèi)切酶、Sau3A I核酸限制性內(nèi)切酶(購自NEB)。水為自制滅菌Milli-Q 純凈水。

1.4 引物序列 豬、牛引物序列參考國家標(biāo)準(zhǔn)及出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的引物的DNA序列[13-14]交由上海生工生物工程公司合成；豬的上游引物序列為5-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3，下游引物序列為5- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3；牛的上游引物序列為5- GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3，下游引物序列為5- GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3。

1.5 樣品檢測

1.5.1 常規(guī)PCR檢測：采用DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products 提取試劑盒對肝水解肽樣品進(jìn)行DNA提取。其中對肝至上清液工藝段樣品，稱取20 mg樣品直接按試劑說明書進(jìn)行提??；而對超濾液至注射液工藝段樣品，均取3 mL進(jìn)行凍干濃縮，將濃縮物加200 μL水復(fù)溶，吸取20 μL溶液進(jìn)行DNPremix Taq 25 μL，引物各1 μL(10 mmol/L， DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)足50 μL。電泳條件：電壓 90 V，時間30 min，用Gel red染色20 min，置于成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.5.2 熒光定量PCR檢測：采用Applied Biosystems 7300 Real-time PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL，2×Premix 12.5 μL，Primer Mix 1 μL，Proble Mix 1 μL，DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共40個循環(huán)。

1.5.3 PCR產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證:酶切條件：豬源性陽性對照PCR產(chǎn)物按照Mnl I核酸限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件操作。牛源性陽性對照PCR產(chǎn)物按照Sau3A I核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件操作。

2 結(jié)果

2.1 肝水解肽樣品(牛、豬源性)樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳 肝水解肽樣品(牛源性)樣品用PCR法擴(kuò)增出271 bp的?；颍嗡怆臉悠?豬源性)樣品用PCR法擴(kuò)增出212 bp的?；?，其大小與預(yù)期結(jié)果相符。從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中，均檢測到牛、豬源性DNA，在上清液及超濾液四中，全部都未檢測出牛、豬源性DNA。見圖1、圖2。

圖1 豬源性的肝水解肽樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖1.Marker；2.無；3.豬肝；4.勻漿液；5.酶解液；7.上清液；8.超濾液一；9.超濾液二；10.超濾液三；11.超濾液四；12-14.擴(kuò)增空白；15.陰性對照；16.MarkerFig.1 Amplification result of porcine derived materials in hydrolysate samples1.Marker;2.Nothing;3.Pork liver;4.Homogenate;5.Enzymatic hydrolysate;7.Supernatant;8.Ultrafiltrate 1;9.Ultrafiltrate 2;10.Ultrafiltrate 3;11.Ultrafiltrate 4;12-14.Amplification blank;15.Negative control;16.Marker

圖2 牛源性的肝水解肽樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖1.Marker；2.牛肝；3.勻漿液；4.酶解液；5.上清液；6.超濾液一；7.超濾液二；8.超濾液三；9.超濾液四；10.擴(kuò)增空白；11.陰性對照；12.MarkerFig.2 Amplification result of bovine derived materials in hydrolysate samples 1.Marker;2.beef liver;3.Homogenate;4.Enzymatic hydrolysate;5.Supernatant;6.Ultrafiltrate 1;7.Ultrafiltrate 2;8.Ultrafiltrate 3;9.Ultrafiltrate 4;10.Amplification blank;11.Negative control;12.Marker

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證 針對陽性結(jié)果，分別對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，271bp的牛源性PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切的得到214bp和57bp的DNA片段，確證為牛源性成分。212bp的豬源性PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切的得到196bp和16bp的DNA片段，確證為豬源性成分。見圖3。

圖3 牛、豬源性PCR產(chǎn)物限制性酶切電泳圖1.20bpDNA Marker；2.牛PCR產(chǎn)物；3.牛酶切產(chǎn)物；4.豬PCR產(chǎn)物；5.豬酶切產(chǎn)物Fig.3 Restriction enzyme result of bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples1.20bpDNA Marker;2.Beef PCR product;3.Beef restricted DNA products;4.Pork PCR product;5.Pork restricted DNA products

2.3 肝水解肽各工藝步驟段樣品熒光定量PCR的檢測結(jié)果 分別按試劑盒操作要求對檢測肝水解肽樣品(牛、豬源性樣品)，DNA提取液進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，并根據(jù)樣品的Ct值對結(jié)果進(jìn)行判定。檢測結(jié)果與常規(guī)PCR相同，肝水解肽樣品(牛、豬源性樣品)DNA提取液在使用相對應(yīng)的物種檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增時，酶解液及其之前的檢測結(jié)果及陽性對照有擴(kuò)增曲線均為陽性，上清液至注射液檢測，未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但Ct值大于35.0，結(jié)果為陰性。見圖4、圖5。

圖4 牛源性肝水解肽樣品熒光定量擴(kuò)增圖Fig.4 Bovine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR

圖5 豬源性肝水解肽樣品熒光定量擴(kuò)增圖Fig.5 Porcine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

目前，生化藥物大多以豬、牛、羊等動物的臟器組織為原料，經(jīng)過分離提取獲得，不同動物種屬提取的生物大分子[15]。動物種屬來源鑒別方法目前在美國藥典37版、英國藥典2013版、日本藥局方2011版、歐洲藥典8.0版及中國藥典2010年版均未收載。我國目前現(xiàn)有的豬、牛及羊PCR種屬鑒別的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)均參照中國出入鏡檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以生化藥物中有代表性的肝水解肽為研究對照，研究結(jié)果表明熒光定量PCR和常規(guī)PCR均可對肝水解肽各工藝步驟段樣品中酶解液之前的各工藝步驟段樣品進(jìn)行豬、牛源性成分的檢測，這和一些文獻(xiàn)報道的熒光定量PCR技術(shù)檢測敏感性高于常規(guī)PCR不一致[16]。分析原因?yàn)樨i(牛)肝經(jīng)過多個工藝步驟的處理，上清液至注射液各工藝步驟段樣品特別是在超濾步驟中，采用超濾膜去除對大分子物質(zhì)，使得樣品中殘留的大分子DNA量大大減少，當(dāng)模板量較低時，無論是熒光定量PCR技術(shù)還是常規(guī)PCR檢測結(jié)果均為陰性。何素婷等[17]研究常規(guī)PCR檢測肝水解肽樣品結(jié)果中發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR可以對肝水解肽樣品各工藝步驟段中超濾液四之前的樣品進(jìn)行豬、牛源性成分的檢測。這個結(jié)果差異分析原因?yàn)楦髯允褂肈NA提取的試劑盒不一致，導(dǎo)致結(jié)果有差別。本研究使用的DNA試劑盒為DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products，其主要是針對肉類制品，故對于豬(牛)肝、豬(牛)勻漿液、豬(牛)酶解液這一些提取DNA比較合適。而后續(xù)上清液至注射液各工藝步驟段樣品因幾乎不含肉類，加之后續(xù)步驟超濾對DNA損失的影響，故DNA未能被提取出來，所以熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測結(jié)果均為陰性。當(dāng)然濃縮的過程也可能會導(dǎo)致DNA的模板量低于檢測限，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)核實(shí)。

同常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR檢測肝水解肽樣品中牛、豬源性成分更為簡單，耗時短。

[1] 李勇. 生物活性肽研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(1)：3-9.

[2] 傅穎，梅松，王茵. 新生牛肝活性肽對小鼠的免疫增強(qiáng)作用[J].中國生物制品學(xué)雜志，2008，21(1)： 47-50.

[3] Fukuda Y,Sawata M,Washizuka M,et al. Effect of liver hydroly-sate on hepatic proliferation in regenerating rat liver[J].Nippon Yakurigaku Zasshi,1999,114(4):233-238.

[4] 陳文炳，邵碧英，李壽崧，等.加工食品中若干動物成分的PCR檢測技術(shù)應(yīng)用研究[J].食品科學(xué)，2005，26 (8)：338-342.

[5] Huang Q,Xu T,Wang GY,et al.Species-specific identification of ruminant components contaminating industrial crude porcine heparin using real-time fluorescent qualitative and quantitative PCR[J]. Anal Bioanal Chem,2012,402(4):1625-1634.

[6] 楊寶華，宗卉，林慶燕，等.用分子生物學(xué)方法鑒別檢測動物源性飼料中的牛羊源性成分[J].中國畜牧雜志，2002,38(1)：3-5.

[7] 高丹丹，曹郁生，王迎華.PCR技術(shù)在食品動物源性檢測中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(1)：141-144.

[8] 陳穎，錢增敏，徐寶梁，等.保健品中牛羊源性成分的PCR檢測[J].食品科學(xué)，2004，25(10)：215-218.

[9] 王麗媛，葉建榮，李興民，等.PCR技術(shù)檢測食品與飼料中動物源成分[J].保鮮與加工，2006，6(4)：33-36.

[10] Tartaglia M, Saulle E, Pestalozza S, et al.Detection of bovine mito-chondrial DNA in ruminant feeds: a molecular approach to test for the presence of bovine derived materials[J]. J Food Prot, 1998,61(5): 513-518.

[11] Tartaglia M,Saulle E. Rapid communication: Nucleotide sequence of procine and ovine tRNA and ATPase mitochondrial genes[J]. J Anim Sci,1998,76(8): 2207-2208.

[12] Lahiff S,Glennon M,O'Brien L,et al. Species -specific PCR for the identification of ovine, procine and chicken species in meat and bone meal( MBM)[J]. Mol Cell Probes,2001,15(1): 27-35.

[13] GB/T 21101—2007, 動物源性飼料中豬源性成分定性檢測方法 PCR方法[S], 2007.

[14] SN/T 2051—2008, 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實(shí)時PCR法[S], 2008.

[15] 蔣桂香，李延平，劉中原，等.肝水解肽的制備及相對分子質(zhì)量分布研究[J].中國生化藥物雜志，2012，33(5)：603-606.

[16] 林潮雙，陳文思，盧建溪，等.熒光定量PCR與RT-PCR技術(shù)檢測HCV-RNA的比較觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)，2000，4(4)：176-178.

[17] 何素婷，段徐華，邵泓，等.肝水解肽樣品中牛源及豬源性成分的 PCR 檢測[J].藥物分析雜志，2012，32(6)：1064-1068.

(編校：王冬梅)

Comparative study of bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR

YU Yan1, HE Su-ting2, WANG Zi-qiang2, DENG Feng1Δ

(1. Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo compare real-time fluorescence quantitative PCR with general PCR in detecting bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples.MethodsDNA were extracted from hydrolysate samples which prepared by different steps by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR.ResultsDNA of bovine and porcine could be detected by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR in samples prepared in the processes before enzymolysis solution, but not detected in samples from supermatant to the fourth ultrafiltrate.ConclusionBoth real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR can be applied to detect the fragments in hydrolysate samples.And real-time fluorescence quantitative PCR has the advantage such as rapid,convenient, non-environment-polluted, good repeatability, which improves the quality and efficiency.

hydrolysate; real-time fluorescence quantitative PCR; general PCR;bovine derived materials; porcine derived materials

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2014093、A2013158)

余燕，女，碩士，主管藥師，研究方向：分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用；E-mail：yuyan921124 @126.com；鄧鋒，通訊作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，E-mail：494409425@qq.com。

R917

A

1005-1678(2015)05-0018-03