王曉先，李飛，張碩，徐月華

(1.解放軍第456醫(yī)院 藥械科，山東 濟(jì)南 250031；2.解放軍第456醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

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二甲雙胍調(diào)節(jié)自噬改善大鼠局灶性腦缺血后焦慮樣行為

王曉先1，李飛2，張碩2，徐月華2

(1.解放軍第456醫(yī)院 藥械科，山東 濟(jì)南 250031；2.解放軍第456醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討二甲雙胍對大鼠局灶性腦缺血后焦慮和自噬途徑的影響。方法 將大鼠分為7組：假手術(shù)組、缺血組、二甲雙胍組、化合物C組、化合物C+缺血組、二甲雙胍+缺血組、二甲雙胍+化合物C+缺血組。二甲雙胍和化合物C分別在大鼠局灶性腦缺血手術(shù)前14 d、30 min給藥。記錄缺血再灌注72 h后大鼠模型的血糖、體質(zhì)量、神經(jīng)行為學(xué)評分及高架十字迷宮系統(tǒng)指標(biāo)。Western blot檢測大鼠海馬部位自噬相關(guān)基因Atg-7、Atg-5、beclin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 二甲雙胍對大鼠的體質(zhì)量和血糖無顯著影響。預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著提高(P<0.01)。高架下十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠開臂滯留時(shí)間百分比顯著提高(P<0.01)，但對進(jìn)入開臂次數(shù)無顯著影響。Western blot結(jié)果顯示，預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠自噬相關(guān)蛋白Atg-7、Atg-5、beclin-1蛋白表達(dá)顯著高于缺血組(P<0.001)?；衔顲抵抗二甲雙胍的上述作用(P<0.01)。結(jié)論 二甲雙胍通過調(diào)節(jié)自噬能改善大鼠局灶性腦缺血引起的心理和運(yùn)動障礙。

二甲雙胍；局灶性腦缺血；焦慮；自噬

二甲雙胍是2型糖尿病患者常用藥物。其主要作用機(jī)制是激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，屬于細(xì)胞內(nèi)能量傳感器激酶[1]。AMPK在許多神經(jīng)退行性疾病中的作用已經(jīng)明確，比如：腦缺血、亨廷頓病和阿爾茨海默病[2-3]。二甲雙胍通過磷酸化AMPK調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元的下游信號通路[4]。

與人腦缺血類似，大鼠腦缺血后也會出現(xiàn)運(yùn)動改變、焦慮樣行為和神經(jīng)功能缺如[5]。二甲雙胍可在改善氧化應(yīng)激反應(yīng)后認(rèn)知障礙和焦慮中發(fā)揮重要作用[6]。但是二甲雙胍在腦缺血性損傷中的作用仍然不明確。自噬是通過自噬溶酶體系統(tǒng)對自身細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異物、損傷和衰老細(xì)胞器進(jìn)行吞噬降解的過程。而自噬相關(guān)基因包括：Atg5、Atg7、Atg12、beclin-1。研究證明[7]，在正常和應(yīng)激情況下，AMPK信號通路調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮相應(yīng)的作用。研究顯示[8]，自噬與腦缺血后行為學(xué)改善具有一定的聯(lián)系。本研究旨在探討二甲雙胍是否通過調(diào)節(jié)自噬改善大鼠腦缺血引起的焦慮和神經(jīng)功能缺失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：42只健康成年雄性Wistar大鼠(8周齡)，體質(zhì)量280～300g，購自濟(jì)南市金豐實(shí)驗(yàn)動物繁殖有限公司，許可證號為SCXK(魯)2014-0006。

1.1.2 藥品和試劑：鹽酸二甲雙胍片購于白云山湯陰東泰藥業(yè)有限責(zé)任公司(國藥準(zhǔn)字H41020541)；化合物C(AMPK抑制劑)購于上海浩然生物科技有限公司；兔抗Atg7、Atg5、beclin-1多克隆抗體和鼠抗β-actin多克隆抗體(美國Sigma公司)；山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；ECL顯色劑(美國Amersham Bioscience公司)；戊巴比妥鈉(上海哈靈生物試劑檢測中心)。

1.1.3 儀器：大小鼠高架十字迷宮(YH-EPM/R，武漢一鴻科技有限公司)；血糖檢測儀(德國羅氏公司)；凝膠成像儀掃描系統(tǒng)(美國伯樂公司生產(chǎn)，型號GEL Doc XR+)；紅外線測溫儀(德國歐普士Optris微小型紅外測溫儀CS micro)；SDS-PAGE電泳(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號SCZ2+)。

1.2 方法

1.2.1 分組：采用數(shù)字表法將大鼠分為7組，每組6只，分別為：假手術(shù)組、缺血組、二甲雙胍組、化合物C組、化合物C+缺血組、二甲雙胍+缺血組、二甲雙胍+化合物C+缺血組。二甲雙胍和化合物C分別在大鼠局灶性腦缺血手術(shù)前14 d、30 min給藥。在處理前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 大鼠局部腦缺血再灌模型制備：參照文獻(xiàn)方法[9]制備大鼠局部腦缺血再灌模型，二甲雙胍(生理鹽水溶解為濃度20 mg/mL)在手術(shù)前14 d以200 mL/kg劑量腹腔注射；化合物C(PBS溶解為濃度4 mg/mL)均在手術(shù)前30 min以40 mL/kg劑量腹腔注射。手術(shù)方法如下：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(35 mg/kg)，自頸部行1 cm長的正中切口，暴露胸鎖乳突肌。手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)頸動脈鞘并游離出頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，然后用5/0縫合絲線雙重結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠(yuǎn)心端；在頸總動脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)并輕輕提起以阻斷血流，在頸外動脈遠(yuǎn)端的動脈壁上用針頭扎一個(gè)小口，將制備好的線栓從小孔插入頸總動脈至頸內(nèi)動脈并進(jìn)而向上到達(dá)大腦中動脈，固定線栓，將下頜下腺歸位，30 min后拔出線栓，縫合皮膚。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓。缺血再灌注后72 h進(jìn)行行為學(xué)檢測。。

1.2.3 行為學(xué)檢測：缺血后再灌72 h，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法采用神經(jīng)殘疾狀態(tài)表(neurological disability status scale，NDSS)[10]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分：無明顯神經(jīng)行為學(xué)改變；2分：低反應(yīng)性、輕度的活動減少；4分：機(jī)體張力和肌肉強(qiáng)度降低，扁平姿勢，側(cè)的姿勢，共濟(jì)失調(diào)步態(tài)，中度活動減少；6分：轉(zhuǎn)圈，顫撞，前肢屈曲，活動明顯減少，輕度運(yùn)動失調(diào)等；8分：重度運(yùn)動失調(diào)，呼氣窘迫，重度活動減少；10分：死亡；其他：將靠近以上標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)行為學(xué)癥狀分別定義為1、3、5、7、9分。分值越高，損傷程度越嚴(yán)重。

1.2.4 血糖和體質(zhì)量檢測：手術(shù)前及缺血再灌注后72 h，檢測大鼠的體質(zhì)量，尾靜脈采血并用血糖檢測儀檢測血糖。

1.2.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[11]，將缺血再灌72 h的大鼠放于迷宮中央，頭朝開臂，觀察者距離迷宮中心至少1 m。分別記錄實(shí)驗(yàn)期內(nèi)(30 min)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留的時(shí)間(進(jìn)出臂標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該嚴(yán)格界定，以四肢全部入臂或兩前肢為準(zhǔn))。計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間分別占總次數(shù)(進(jìn)入開臂或閉臂次數(shù)之和)與總時(shí)間(在開臂與閉臂滯留時(shí)間之和)的百分比，以此作為評價(jià)焦慮的指標(biāo)。通常兩指標(biāo)間呈高度正相關(guān)。如果某藥物增加大鼠對開臂的偏愛，而不改變?nèi)氡劭偞螖?shù)，則認(rèn)為某藥有抗焦慮作用。

1.2.6 Western blot分析：采用改良的 Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法制作大鼠全腦缺血模型，大鼠缺血30 min后松口動脈夾，進(jìn)行再灌注，同時(shí)采用紅外線測溫儀監(jiān)測耳內(nèi)鼓膜溫度。行為學(xué)檢測后，提取缺血大鼠海馬區(qū)總蛋白，按10 mL/g比例加入全細(xì)胞裂解液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸鹽緩沖液(PBS-T)洗膜3次，每次5 min。用兔抗Atg7、Atg5、beclin-1多克隆抗體(1:1000)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1:5000)常溫孵育3 h，PBS-T洗3次，每次5 min。用山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1:5000)，室溫孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。洗膜后用凝膠成像儀掃描系統(tǒng)檢測，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one?1-D進(jìn)行吸光度分析。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對腦缺血大鼠生理參數(shù)的影響 與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠的體質(zhì)量和血糖無明顯變化。預(yù)先給予二甲雙胍也未影響大鼠的體質(zhì)量和血糖，且二甲雙胍+缺血組大鼠的體質(zhì)量和血糖也無顯著改變。見表1。

表1 缺血再灌注72 h后各組體質(zhì)量和血糖變化±s)Tab.1 Changes of body mass and blood glucose level at 72 h after ischemia ±s)

2.2 二甲雙胍對腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響 缺血組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)。預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著提高(P<0.01)?；衔顲組神經(jīng)行為學(xué)評分與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二甲雙胍+化合物C+缺血組神經(jīng)行為學(xué)評分與缺血組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而二甲雙胍+缺血組神經(jīng)行為學(xué)評分顯著高于二甲雙胍+化合物C+缺血組(P<0.01)。見表2。

表2 缺血再灌注72 h后各組神經(jīng)行為學(xué)評分比較±s)Tab.2 Comparison of neurological scores of each group at 72 h after ischemia ±s)

***P<0.001，與假手術(shù)組比較，compared with sham group；##P<0.01，與缺血組比較，compared with I/R group；△△P<0.01，與二甲雙胍+缺血組比較，compared with metformin+I/R group

2.3 二甲雙胍影響腦缺血大鼠焦慮樣行為 高架下十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血組開臂滯留時(shí)間百分比顯著高于假手術(shù)組(P<0.001)，但缺血組進(jìn)入開臂次數(shù)百比分無顯著變化。二甲雙胍+缺血組開臂滯留時(shí)間百分比顯著高于缺血組(P<0.01)，但二甲雙胍+缺血組進(jìn)入開臂次數(shù)無顯著變化。二甲雙胍或化合物C(AMPK抑制劑)組對開臂滯留時(shí)間無顯著影響?；衔顲預(yù)處理削弱二甲雙胍在缺血組中的抗焦慮作用，使進(jìn)入開臂次數(shù)百分比顯著降低(P<0.01)。見圖1。

圖1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)**P<0.01；***P<0.001，與假手術(shù)組比較；##P<0.01，與缺血組比較；△△P<0.01，與二甲雙胍+缺血組比較Fig.1 Result of elevated plus maze test(n=6)**P<0.01；***P<0.001，compared with sham group；##P<0.01，compared with I/R group；△△P<0.01，compared with metformin + I/R group

2.4 二甲雙胍對腦缺血大鼠海馬自噬蛋白的影響 Western blot檢測缺血大鼠海馬自噬蛋白Atg-7、Atg-5、beclin-1的表達(dá)結(jié)果顯示，缺血組Atg-7、Atg-5、beclin-1蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P<0.001)，而二甲雙胍+缺血組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)又顯著高于缺血組(P<0.001)。二甲雙胍組和化合物C組中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二甲雙胍+化合物C+缺血組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著低于二甲雙胍+缺血組(P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot分析各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)(n=6)***P<0.001，與假手術(shù)組比較；#P<0.05，###P<0.001，與缺血組比較；△△△P<0.001，與二甲雙胍+缺血組比較Fig.2 Expression of autophagy-related protein analysed by Western blot of each group(n=6)***P<0.001，compared with sham group；#P<0.05，###P<0.001，compared with I/R group；△△△P<0.001，compared with metformin + I/R group

3 討論

腦缺血可以導(dǎo)致海馬CA1區(qū)嚴(yán)重凋亡和壞死，海馬區(qū)是大腦最容易受到損傷的部位[2]。海馬區(qū)是邊緣系統(tǒng)的一部分，參與情緒、感覺和認(rèn)知的調(diào)節(jié)。二甲雙胍在神經(jīng)退行性疾病中的保護(hù)作用已經(jīng)明確。能夠減輕糖尿病大鼠局灶性腦缺血焦慮樣行為和感覺運(yùn)動評分[12]。本研究顯示，預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著提高(P<0.01)，開臂滯留時(shí)間百分比顯著提高(P<0.01)，而化合物C減弱二甲雙胍的神經(jīng)保護(hù)作用。二甲雙胍預(yù)處理可以緩解大鼠腦缺血引起的神經(jīng)功能缺失和焦慮樣行為。

為了闡明大鼠的生理狀態(tài)，本課題組人員檢測各組大鼠的體質(zhì)量和血糖。各組間體質(zhì)量和血糖無差異性變化。Girbovan等[13]研究表明腦缺血發(fā)作時(shí)對血糖無影響。因?yàn)槿毖獣r(shí)最易受到損傷的是海馬區(qū)，而不是下丘腦，下丘腦調(diào)節(jié)食欲和血糖。二甲雙胍可以降低糖尿病患者的血糖[14]，但是本研究中二甲雙胍對假手術(shù)組和缺血組血糖均無影響。也有研究報(bào)道二甲雙胍在14d治療期間對非糖尿病局灶性腦缺血小鼠的血糖無影響[15]。因而，下一步需要評價(jià)不同劑量的二甲雙胍對局灶性腦缺血小鼠長期血糖的影響。

多年來一直認(rèn)為激活的自噬引起細(xì)胞死亡。然而，自噬也可在保護(hù)性途徑中激活。研究證實(shí)，AMPK、絲裂原活化蛋白激酶和Akt調(diào)節(jié)保護(hù)作用的自噬[16-17]。Ashabi等[2]激活A(yù)MPK誘導(dǎo)缺血損傷后海馬神經(jīng)元的自噬。本研究結(jié)果顯示，預(yù)先給予二甲雙胍可使缺血組大鼠自噬相關(guān)蛋白Atg-7、Atg-5、beclin-1蛋白表達(dá)顯著高于缺血組(P<0.001)。本研究假設(shè)二甲雙胍通過調(diào)節(jié)AMPK發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍增強(qiáng)缺血性大鼠的自噬功能，而AMPK抑制劑化合物C抵消二甲雙胍的作用。此結(jié)果提示，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK發(fā)揮作用，而激活A(yù)MPK使自噬增強(qiáng)在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，二甲雙胍對局灶性腦缺血大鼠具有抗焦慮和神經(jīng)保護(hù)作用，并通過激活A(yù)MPK發(fā)揮作用。

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(編校：王儼儼)

Metformin improving anxiety-like behaviors through regulation of autophagy following focal cerebral ischemia in rats

WANG Xiao-xian1, LI Fei2, ZHANG Suo2, XU Yue-hua2

(1. Department of Medicine and Appliance, The 456th Hospital of PLA, Ji’nan 250031, China; 2. Department of Neurology, The 456th Hospital of PLA, Ji’nan 250031, China)

ObjectiveTo investigate probable effect of metformin on anxiety and autophagy pathway in rats with focal cerebral ischemia.MethodsThe rats were divided into seven groups: shame group, ischemia group, metformin group, compound C group, compound C +ischemia group, metformin+ischemia group, and metformin+compound C+ischemia group. The rats were administered with metformin 14 days and compound C 30 min pretreatment. The blood glucose level, body mass, neurological score and indicators of elevate plus maze test were recorded of two groups after 72h ischemia-perfusion. The autophagy-related protein of Atg-7, Atg-5, beclin-1 were analysed by Western blot.ResultsMetformin had no significant effect of body mass and blood glucose level. The prior administration of metformin significantly elevated neurological score in ischemia group (P<0.01). The elevate plus maze test results showed that prior administration of metformin significantly elevated percentage of open-arms detention time in ischemia group (P<0.01), but there was no significant difference in open-arms times. Western blot result showed that prior administration of metformin significantly elevated Atg-7, Atg-5, beclin-1 protein expression in ischemia group (P<0.001). Compound C resist the above effects of metformin (P<0.01).ConclusionThe metformin improves psychological disorders and movement disability through regulation of autophagy following focal cerebral ischemia in rats.

metformin; focal cerebral ischemia; anxiety; autophagy

王曉先，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：wangxiaoxianjn@126.com。

R915

A

1005-1678(2015)08-0062-04