孫巖，劉家寶

(天津市南開醫(yī)院 藥學(xué)部，天津 300100)

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小白菊內(nèi)酯對多柔比星所致大鼠腎損傷的保護(hù)作用及抗氧化機(jī)制

孫巖，劉家寶Δ

(天津市南開醫(yī)院 藥學(xué)部，天津 300100)

目的 研究小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTN)對多柔比星(doxorubicin，DOX)腎損傷大鼠腎功能的保護(hù)作用和其氧化應(yīng)激的機(jī)制。方法 48只SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、溶媒組、PTN(1.5、3、6 mg/kg)劑量組，每組8只。尾靜脈一次性注射5 mg/kg多柔比星制備腎損傷模型，連續(xù)PTN給藥7d后取血檢測大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平，腎組織中一氧化氮(nitricoxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，同時取腎組織用HE染色觀察腎組織病理改變。結(jié)果 模型組大鼠腎臟的組織病理學(xué)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為嗜堿性變，間質(zhì)炎性增生、炎性浸潤；經(jīng)PTN干預(yù)后，PTN 6 mg/kg組中大鼠腎臟組織病理變化減輕，輕度炎性浸潤。PTN 1.5 mg/kg組、PTN 3 mg/kg組、PTN 6 mg/kg組BUN、Cr含量顯著低于模型組(P<0.05)；PTN 3 mg/kg組、PTN 6 mg/kg組BUN、Cr含量與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，3個PTN劑量組SOD、GSH活性顯著升高而MDA水平顯著下降(P<0.05)；PTN 3 mg/kg組、PTN 6 mg/kg組SOD水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PTN 6 mg/kg組GSH活性、MDA水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，3個PTN劑量組NO水平、NOS活性顯著升高(P<0.05)；PTN 6 mg/kg組NO水平、NOS活性與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 小白菊內(nèi)酯對多柔比星所致大鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用，可能與提高腎臟抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

小白菊內(nèi)酯；多柔比星；腎損傷；抗氧化

小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTN)是從天然藥用植物艾菊中提取出來的具有抗炎抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等多種藥理作用的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物[1-2]，但目前對小白菊內(nèi)酯的研究主要以體外研究為主，研究顯示對高糖肥胖環(huán)境下氧化損傷中有一定保護(hù)作用[3]，但其對藥物造成腎損傷的研究尚未見報道，因此，本研究制備了多柔比星(doxoyubicin，DOX)腎損傷的模型，探討PTN對DOX造成的藥源性的腎臟氧化應(yīng)激損傷是否具有保護(hù)作用，為合理使用PTN治療藥源性的腎臟氧化應(yīng)激提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級SD雄性大鼠56只，動物許可證號：SCXX(京)2007-0001，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，5周齡，飼養(yǎng)至體質(zhì)量200～240 g，動物實(shí)驗(yàn)均遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

儀器及試劑：全自動血液生化分析儀(日本Hitachi公司)；顯微鏡(Olympus，DM2000)。小白菊內(nèi)酯(PTN，美國Sigma公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)、一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)和一氧化氮(nitricoxide，NO)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；注射用鹽酸多柔比星(doxorubicin，DOX)，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1022E7；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，批號：C0105)。

1.2 動物分組[4-5]大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、PTN 1.5 mg/kg組、PTN 3 mg/kg組、PTN 6 mg/kg組及溶媒組，每組8只。PTN采用二甲基亞砜(DMSO)溶解，注射前用生理鹽水依次倍比稀釋至相應(yīng)濃度，尾靜脈注射時DMSO的最終濃度不超過0.5%，每只大鼠給藥體積為1 mL/100g，除正常組大鼠以外，剩下的其余各組大鼠尾靜脈一次性注射DOX 5 mg/kg，DOX采用生理鹽水溶解，正常組尾靜脈注射等量生理鹽水，給藥體積為1 mL/100 g，1周后檢測尿蛋白含量2.0～4.0 g/L的為造模成功大鼠，為DOX腎氧化損傷的毒性模型，造模成功率為75%，PTN 1.5、3、6 mg/kg組分別尾靜脈注射相應(yīng)劑量的PTN，溶媒組給予0.5%的二甲基亞砜，正常組和模型組給予生理鹽水，連續(xù)給藥1周。

1.3 樣品處理步驟 末次給藥24 h后將大鼠在封閉空間內(nèi)用乙醚麻醉，在無菌條件下迅速采用一次性無菌注射器腹主動脈取血5 mL，后放入離心管于4 ℃ 10000 r/min離心5 min，制備血清，吸取上清液，全自動生化分析儀檢測血清BUN和Cr。

末次給藥24 h后將大鼠麻醉，迅速取腎臟，將右側(cè)腎臟橫向剖開，取出1 g腎組織加入9 mL生理鹽水于玻璃勻漿管中制成10%組織勻漿，于4 ℃ 12000g離心20 min，取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，采用TBA法測定MDA含量、羥胺法測定SOD含量、比色法檢測GSH含量、硝酸還原酶法測定NO含量，比色法檢測NOS活性。

末次給藥24 h后將大鼠麻醉，迅速取腎臟，將右側(cè)腎臟橫向剖開，取其中1/2腎組織，用體積分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛固定48 h，然后進(jìn)行常規(guī)的脫水后石蠟包埋，切片機(jī)制片，采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 PTN對DOX致腎損傷大鼠腎組織病理學(xué)的影響 通過對腎組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常、腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，無異常病理表現(xiàn)。模型組大鼠腎臟的組織病理學(xué)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為嗜堿性變，間質(zhì)炎性增生、炎性浸潤。經(jīng)PTN干預(yù)后，PTN 6 mg/kg組中大鼠腎臟組織病理變化減輕，輕度炎性浸潤。見圖1。

圖1 PTN對DOX致腎損傷大鼠腎病理影響(HE，×400)Fig.1 Effects of PTN on histopathological changes in renal tissues of rats damaged by DOX(HE staining, ×400)

2.2 PTN對DOX致腎損傷大鼠血清肌酐和尿素氮的影響 模型組血清BUN、Cr含量顯著高于空白組(P<0.05)，3個劑量組中BUN、Cr含量顯著低于模型組(P<0.05)，PTN 6 mg/kg組、PTN 3 mg/kg組中BUN、Cr含量與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

組別只數(shù)BUNCr空白組88.35±1.6762.1±6.4模型組818.73±2.87#133.6±31.6#PTN1.5mg/kg組814.46±1.60*#94.6±15.5*#PTN3mg/kg組89.34±1.15*64.5±15.2*PTN6mg/kg組88.87±1.02*59.8±4.8*溶媒組88.22±2.7865.0±3.3

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group；#P<0.05，與空白組比較，compared with blank group

2.3 PTN對DOX致腎氧化損傷大鼠腎GSH及SOD活性和MDA水平的影響 與空白組相比，模型組SOD、GSH活性顯著下降而MDA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，3個劑量組SOD、GSH活性顯著升高而MDA水平顯著下降(P<0.05)。PTN 6 mg/kg組、PTN 3 mg/kg組SOD水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PTN 6 mg/kg組 GSH活性、MDA水平與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 PTN對DOX致腎損傷大鼠腎MDA水平、GSH及SOD活性的影響Tab.2 Effect of PTN on MDA，GSH and SOD in renal tissue of rats with doxorubicin-induced nephropathy ±s)

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group；#P<0.05，與空白組比較，compared with blank group

2.4 PTN對DOX致腎損傷大鼠腎NO含量和NOS活性的影響 與空白組相比，模型組NO水平、NOS活性顯著下降(P<0.05)。與模型組相比，3個劑量組NO水平、NOS活性顯著升高(P<0.05)。PTN 6 mg/kg組 NO水平、NOS活性與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 PTN對DOX致腎損傷大鼠腎NO水平和NOS活性的影響Tab.3 Effect of PTN on NO and NOS in renal tissue of rats with doxorubicin-induced ±s)

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group；#P<0.05，與空白組比較，compared with blank group

3 討論

PTN是從具有鎮(zhèn)痛、抗菌及抗腫瘤作用的天然藥用植物艾菊中提取出來的具有抗炎抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等多種藥理作用的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，可發(fā)揮包括抗炎及抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等各種生物活性作用，具有良好的應(yīng)用前景。目前，對PTN的研究報道并不多，其主要以體外研究為主，尤其是其抗氧化作用的研究報道很少，體外研究證實(shí)其抗氧化作用是通過抑制自由基ROS和RNS或下游氧化應(yīng)激通道而產(chǎn)生的，但在藥物性腎損傷中尚未見報道研究，腎臟是藥物代謝和排泄的重要器官，藥物性腎損害日益增多，成為不容忽視的問題。本研究采用DOX腎毒性模型，研究顯示該模型與氧化應(yīng)激有關(guān)。

血清Cr、BUN含量在一定程度上可反映腎小球?yàn)V過功能的損害程度，當(dāng)腎臟功能受損傷時，腎小球?yàn)V過率下降，血清Cr、BUN含量會升高[6]，在本研究中，大鼠經(jīng)過DOX損傷后，血清中Cr、BUN含量顯著升高(P<0.05)，說明DOX對大鼠腎臟造成了損傷，腎損傷模型制備成功，PTN干預(yù)后，Cr、BUN的含量在PTN 6 mg/kg、PTN 3 mg/kg組中出現(xiàn)了明顯下降(P<0.05)，腎臟功能明顯改善，說明PTN對DOX致腎損傷有一定保護(hù)作用。

MDA、SOD和GSH水平能很大程度上反映機(jī)體抗氧化能力[7-8]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PTN的抗氧化能力，結(jié)果顯示通過PTN干預(yù)后，腎組織MDA含量在PTN 6 mg/kg組中明顯下降，而SOD和GSH活性提高(P<0.05)，PTN 1.5 mg/kg組治療效果較差，表明PTN對腎損傷的保護(hù)作用有一定的劑量依賴關(guān)系，腎臟病理學(xué)檢查同樣證實(shí)PTN會明顯改善DOX引起的腎損傷，腎臟病理形態(tài)及腎功能明顯改善。

內(nèi)源性NO、NOS是維持機(jī)體組織正常生理功能的關(guān)鍵因素，也參與對抗氧化損傷[9-10]，NOS是催化NO生成的唯一限速酶。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX損傷后模型大鼠腎組織NO含量和NOS活性均出現(xiàn)降低(P<0.05)，說明DOX對腎臟造成了損傷，進(jìn)一步損傷了腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致NO含量和NOS活性均出現(xiàn)降低，PTN 6 mg/kg組NOS活性增加，NO含量升高，說明PTN對DOX致腎臟氧化損傷有保護(hù)作用。

綜上所述，PTN對DOX致腎氧化損傷有直接的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制是通過降低活性氧的產(chǎn)生，提高機(jī)體抗氧化組織能力有關(guān)，為進(jìn)一步開發(fā)PTN成為一個臨床上治療腎損傷的藥物提供了參考依據(jù)。

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(編校：王儼儼)

Protective effect and mechanism of parthenolide in rats with doxorubicin-induced nephropathy

SUN Yan, LIU Jia-baoΔ

(Department of Pharmacy, Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)

ObjectiveTo observe protective effects of parthenolide (PTN) in rats with doxorubicin-induced nephropathy and its mechanims.Methods48 male rats were randomly divided into six groups: blank group, model group, vehicle group, and parthenolide-treated group (1.5, 3, 6 mg/kg). The models of doxorubicin-induced nephropathy were established by tail vein injection of 5 mg/kg doxorubicin for one time. After consecutive treatment of PTN for seven days, the BUN and Cr in serum, and nitricoxide (NO), malondialdehyde (MDA), nitricoxidesynthase (NOS), glutathione peroxidase (GSH), superoxide dismutase (SOD) in renal tissues were detected. The pathological changes of renal tissue was observed by HE method.ResultsThere was significant pathological changes of renal tissue in model group, that showed basophilic change, interstitial inflammatory hyperplasia and inflammatory infiltratio, after PTN 6 mg/kg treatment, the above changes significant improved. The serum BUN and Cr levels in PTN 1.5 mg/kg, PTN 3 mg/kg and PTN 6 mg/kg group were lower than those in model group (P<0.05); there were no significant differences of above indexes between PTN 3 mg/kg, PTN 6 mg/kg group and blank gorup. Compared with model group, the SOD and GSH activity were higher and MDA level was lower in three different dosage of PTN groups (P<0.05); there were no significant differences of SOD activity between PTN 3 mg/kg, PTN 6 mg/kg group and blank gorup; there were no significant differences of GSH activity and MDA level between PTN 6 mg/kg group and blank gorup. The NO level and NOS activity in three different dosage of PTN groups were higher (P<0.05); there were no significant differences of NO level and NOS activity between PTN 6 mg/kg group and blank gorup.ConclusionParthenolide has protective effects on doxorubicin-induced nephropathy, and its mechanism might be antioxidative effects.

parthenolide; doxorubicin; nephropathy; antioxidative

孫巖，男，本科，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：sunyannankai@126.com；劉家寶，通訊作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：jnltour@163.com。

R965.1

A

1005-1678(2015)08-0038-03