馬友龍，祁海艷，曹振東，胡大為

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 外四科，河北 承德 067000)

?

多西紫杉醇納米脂質體的制備及其對肝癌細胞的體內外治療研究

馬友龍，祁海艷，曹振東，胡大為

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 外四科，河北 承德 067000)

目的 制備多西紫杉醇(docetaxel,DOC)納米脂質體顆粒(docetaxel nano liposome，L-DOC)，研究其對肝癌細胞體內，體外的治療作用。方法 采用薄膜-超聲分散法制備多西紫杉醇脂質體納米顆粒；表征其粒度大小、Zeta電位隨時間的變化情況以及包封率；采用CCK-8法檢測L-DOC和DOC分別對肝癌細胞HepG2的體外抑制效果并且用流式細胞術雙染法檢測了細胞的死亡方式；每3天通過游標卡尺測量腫瘤體積變化，研究L-DOC和DOC分別在在體水平上對荷瘤鼠腫瘤的抑制作用；每3天稱量小鼠體質量以及對小鼠主要臟器進行HE染色，研究其在體毒性。結果 制備的L-DOC的平均粒度大約為104 nm，Zeta電位為-35.1 mV，靜置96 h后Zeta電位幾乎沒有變化，包封率為(71.2±1.6)%。CCK-8結果顯示不同濃度的DOC分別處理細胞24 h后，均有不同程度的殺傷效果，但是相同濃度的L-DOC分別處理細胞相同時間后，抑制效果優(yōu)于單獨的DOC，尤其是20 μg/mL的濃度，L-DOC顯著比單獨的DOC好(P<0.01)。此外發(fā)現(xiàn)L-DOC和DOC都能引起細胞凋亡。在體實驗結果表明，6 mg/kg的L-DOC表現(xiàn)了很好的腫瘤抑制效果。6 mg/kg的L-DOC和DOC在30 d內均未對小鼠造成明顯的不良反應。結論 薄膜-超聲分散法制備的L-DOC，粒徑小，水溶性和穩(wěn)定性好，在體內體外均能更好的抑制肝癌細胞，并且無不良反應。

多西紫杉醇；納米脂質體；薄膜-超聲分散法；HepG2細胞；腫瘤治療；凋亡

臨床發(fā)現(xiàn)，肝癌作為常見的惡性腫瘤之一，每年我國新發(fā)肝癌人數(shù)約占全球發(fā)病人數(shù)一半以上，因此研制有效的新的抗肝癌藥物及新治療手段已經(jīng)刻不容緩[1]。目前對于肝癌，常用的治療手段為手術、化學療法、放射性療法以及綜合療法等手段[2-3]。其中藥物療法包括化學合成藥和天然提取藥物。而天然藥物的不良反應被公認為小于化學合成藥。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，許多天然提取物可以作為抗肝癌的藥物，比如：雙氫青蒿素、白藜蘆醇等[4-5]。

多西紫杉醇是從紫杉樹中提取出來的，以紫杉醇為化學物質基礎合成出來的一種新的抗癌藥物。適用于局部晚期非小細胞性肺癌或轉移性乳腺癌的治療。也有研究者發(fā)現(xiàn)其對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞有一定的殺傷效果[6]。而近年來發(fā)現(xiàn)，由于多西紫杉醇的水溶性差，目前市售的多西紫杉醇注射劑都是采用吐溫-80和13%乙醇溶液作為溶媒，在臨床給患者靜脈注射時，常會引發(fā)嚴重的過敏反應，因此也限制了其臨床使用?；诖?，研究者們將多西紫杉醇包裹納米微泡或者納米脂質體中，來克服這些缺點，并發(fā)現(xiàn)有一定的效果[6-7]。

脂質體是一種脂質雙分子層結構，可以進入體內被生物降解，不會在體內積累，免疫原性小、無毒，其次可包埋運載水溶性差的藥物，從而達到運輸藥物的作用。目前脂質體被廣泛應用于蛋白質和抗腫瘤藥物等的載體[8-10]。近年來，國內外有研究者報道用納米脂質體來包裹多西紫杉醇的同類藥物紫杉醇[11]， 并且發(fā)現(xiàn)紫杉醇脂質體不僅提高藥物的穩(wěn)定性， 而且減少甚至避免了市售紫杉醇制劑臨床應用中易致敏的缺點。

本研究通過薄膜-超聲分散法制備多西紫杉醇納米脂質體，表征了粒徑，Zeta電位，包封率以及對肝癌細胞體內體外的治療效果，旨在為多西紫杉醇的實驗研究和臨床應用提供可靠的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞及實驗小裸鼠 HepG2肝癌細胞系購自中科院上海細胞庫。細胞在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱、用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。3～5周BALB/c小裸鼠21只, 雌雄各半, 體質量22～26 g，購自中山大學實驗動物中心[SYXK(粵)2012-0081]。本實驗嚴格遵守《實驗動物保護條例》。

1.2 藥品與試劑 多西紫杉醇藥物粉末(購自西安天豐生物科技有限公司，純度為99.6%)。注射用大豆磷脂，膽固醇(購自上海阿拉丁化學試劑公司)；叔丁基甲醚(色譜純)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、甲醇、無水乙醇、乙醚、異丙醇等(購自廣州化學試劑廠)。

1.3 實驗儀器 Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀(購自英國馬爾文公司)；MK3酶標儀(購自賽默飛世爾科技公司)；CCK-8試劑盒FITC/PI試劑盒(購自碧云天試劑公司)；流式細胞儀(AccuriC6，購自美國BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 多西紫杉醇納米脂質體的制備：多西紫杉醇脂質體的制備采用的是常用的薄膜-超聲分散法[12-13]。具體的制備過程為：以質量比5:1的比例稱取大豆磷脂2 g和膽固醇0.4 g，再加入適量的乙醇然后置于圓底燒瓶中搖晃攪拌至完全溶解后, 放入30 ℃水浴、100 r/min的條件下減壓蒸去乙醇, 從而使磷脂和膽固醇在燒瓶壁形成均勻類脂薄膜。然后向燒瓶中加入適量的乙醚來溶解類脂薄膜, 再將脂膜乙醚混懸液超聲振蕩制得類脂溶液。再稱取多西紫杉醇(docetaxel，DOC)原料藥100 mg 先溶于無水乙醇中,待完全溶解后加入到上述類脂溶液中, 再次超聲振蕩混勻, 然后向溶液中加入 100 mL PBS作為水合介質，此時調節(jié)溶液pH值至7.4, 超聲分散10 min，然后再次在30 ℃、100 r/min氮氣流的環(huán)境下減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，直至除盡有機溶劑。最后加入100 mL PBS, 繼續(xù)旋轉混勻至溶液變?yōu)榘胪该鳡罨鞈乙? 即得多西紫杉醇脂質體混懸液。將混懸液通過高壓勻質分散機(1.4×106Pa) 循環(huán)分散10次, 制得多西紫杉醇脂質體。置于4 ℃冰箱保存。

1.4.2 多西紫杉醇脂質體的粒度、Zeta電位、包封率表征：脂質體的粒徑和Zeta 電位的檢測采用的是納米粒度和電位儀測定, 注入電位分析儀的毛細管小池中進行樣本 Zeta 電位的檢測。本研究采用簡單的稱量方法來檢測脂質體的包封率。包封率的測定公式：包封率=[(投藥量-濾液中的藥量)/投藥量]×100%。其中，投藥量通過電子天平測得，濾液中的藥量通過冷凍干燥后用微量天平測得。

1.4.3 細胞活性及凋亡檢測：細胞活性檢測采用的是CCK-8試劑盒，具體操作步驟為：將100 μL細胞懸液(5×103個/孔)接種于96孔板內，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。用0、1、2、10、20和30 μg/mL的DOC和L-DOC分別處理HepG2細胞24 h，然后用10%的CCK-8工作液處理細胞，緊接著在培養(yǎng)箱里孵育20 min，利用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(OD450)。細胞存活率的計算公式如下：

凋亡檢測采用的是FITC/PI試劑盒檢測法，具體為：先用不同的藥物處理貼壁的細胞數(shù)小時，然后收集細胞，用FITC/PI試劑盒對收集的細胞進行染色處理，最后在流式細胞儀檢測FITC和PI的熒光并進行分析。

2 結果

2.1 粒度、Zeta電位、包封率表征 通過肉眼觀察，多西紫杉醇脂質體(L-DOC)混懸液為淡乳白色、半透明溶液，無沉淀物，見圖1。

圖1 多西紫杉醇脂質體混懸液的性狀Fig.1 Character of L-DOC suspension

L-DOC的平均粒徑為104 nm，而且粒徑分布均勻，主要分布在97～110 nm之間，見圖2。L-DOC的Zeta電位為-35.1 mV，將L-DOC靜置96 h，在不同的時間點檢測Zeta電位，發(fā)現(xiàn)其Zeta電位幾乎沒有變化，說明L-DOC的水溶性很好，并且具有很好的穩(wěn)定性，見圖3。通過稱量和計算得到L-DOC的包封率為(71.2±1.6)%。

圖2 L-DOC納米粒徑的表征Fig.2 Characterization of the nanosize for L-DOC

圖3 L-DOC Zeta電位的表征Fig.3 Characterization of the Zeta potential for L-DOC

2.2 細胞活性及凋亡檢測 隨著DOC的濃度(1、2、10、20和30 μg/mL)上升，細胞活性隨之下降，最高能引起70%左右的活性下降，但是相同濃度的L-DOC處理細胞相同時間后，能更多的引起細胞活性的下降，見圖4。正說明L-DOC作為抗癌藥物的優(yōu)勢。通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，20 μg/mL 的L-DOC顯著比相同濃度的DOC的效果好(P<0.01)。20 μg/mL的DOC和L-DOC 處理細胞24 h后，細胞形態(tài)明顯圓，有漂浮的跡象，見圖5。另外，圖6和圖7表明20 μg/mL的DOC和L-DOC引起的細胞死亡方式為凋亡。DOC和L-DOC引起的凋亡率分別為(53±2.3)%和(79±3.1)%。

圖4 不同濃度的DOC和L-DOC分別對HepG2細胞活性的影響Fig.4 Effect of various concentration of DOC and L-DOC on the cell viability of HepG2 cells

圖5 20 μg/mL的DOC和L-DOC處理細胞24 h后的狀態(tài)Fig.5 The morphology of cell treated with 20 μg/mL DOC and L-DOC after 24 h

圖6 20 μg/mL的DOC和L-DOC處理細胞的流式凋亡結果Fig.6 The flow cytometry result of cells after treating with 20 μg/mL DOC and L-DOC

圖7 20 μg/mL的DOC和L-DOC對細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of 20 μg/mL DOC and L-DOC on the cell apoptosis of HepG2 cells

2.3 腫瘤的抑制作用 單獨的DOC在注射藥物后的前6天對腫瘤有一定的抑制作用，但隨后的觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積有明顯的增大現(xiàn)象。而注射相同劑量的L-DOC后，腫瘤的生長被明顯的抑制，這可能是因為藥物可以被脂質體包裹在里面，在腫瘤區(qū)域富集從而發(fā)揮藥效，而單獨的DOC由于水溶性差，容易被機體清除掉，使藥效降低。見圖8。

圖8 同劑量的DOC和L-DOC對荷瘤鼠腫瘤的抑制效果Fig.8 The relative tumor volume change of tumor-bearing mice after treated with the same dose of DOC and L-DOC

2.4 納米脂質體的載體毒性研究 納米材料的在體毒性大小是其能否應用于臨床的重要考察指標之一。本研究通過檢測小鼠體質量以及其主要臟器的HE染色病理切片的方法來考察其毒性。小鼠在被注射藥物后每3天稱量1次體質量，注射生理鹽水、DOC和L-DOC組都沒有使小鼠體質量明顯下降，反而有上升的趨勢，見圖9。這說明，藥物沒有引起小鼠的食物攝入和排出，以及正常的機體代謝情況。小鼠治療結束后，取出主要臟器(心、肝、脾、肺和腎)做HE病理切片，見圖10。注射生理鹽水、DOC和L-DOC組都沒有引起小鼠主要臟器的損傷，這說明，6 mg/kg的L-DOC對小鼠的身體是沒有明顯不良反應。

圖9 DOC和L-DOC的在體毒性研究中荷瘤鼠體重的變化Fig.9 The weight change of tumor-bearing mice in vivo toxicity study

圖10 荷瘤鼠主要臟器的組織HE染色圖片(×400)Fig.10 The HE staining images of main organ(×400)

3 討論

近年來，在臨床上已有許多納米脂質體包裹的藥物應用于患者，并且有很好的治療效果。納米脂質體作為抗癌藥物的載體具有增強療效，延長藥物在體內的循環(huán)時間以及減少藥物毒副作用等優(yōu)點[14]。另外，它的粒徑可調，能夠攜載不同藥物特別是脂溶性藥物和靶向分子等進而來治療腫瘤，這是目前納米藥物的研究熱點[15]。

本研究采用薄膜-超聲分散法制備了L-DOC，方法簡單，成本低。納米粒度及Zeta電位分析儀測定L-DOC，結果發(fā)現(xiàn)其粒徑分布均勻，平均粒徑為104 nm,屬于納米顆粒。Zeta電位為-35.1 mV,帶負電荷，長時間靜置電位變化不大。研究發(fā)現(xiàn)80～200 nm左右的脂質體，高載藥量及穩(wěn)定性，在體內不易被清除，滲透腫瘤組織能力強，可以延長藥物在體內循環(huán)系統(tǒng)的停留時間從而提高藥物的治療效果[16]。

本實驗將多西紫杉醇包封于脂質體形成納米顆粒，克服了DOC水溶性差，這一特點，并發(fā)現(xiàn)脂質體是脂溶性藥物的理想載體。近年來，多西紫杉醇被研究者們認為是最具有潛力的抗惡性腫瘤藥物之一，對多種腫瘤的治療效果顯著，比如乳腺癌、肺癌和宮頸癌等[17-19]。本研究表明DOC能抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，但L-DOC能更好地抑制細胞的增殖。并且檢測到DOC和L-DOC可以引起細胞程序性死亡(凋亡)。在體水平的抗腫瘤效果同樣表明，相同劑量的DOC和L-DOC作用小鼠，L-DOC能夠顯著抑制腫瘤的生長，而DOC只能很短暫的抑制腫瘤生長，腫瘤很快就恢復了生長。其可能的機制是：①DOC水溶性差不能有效的與細胞結合來作用細胞，而L-DOC可以與細胞膜融合將藥物大部分帶到細胞里面而發(fā)揮更好的效果；②DOC在體內中很容易被清除代謝，而L-DOC在體內的循環(huán)周期長，能夠穿透腫瘤組織進入到腫瘤內，并且在實體瘤組織的高通透性和滯留效應(EPR效應)下，富集在腫瘤區(qū)域發(fā)揮長時間的作用[20]。

本實驗通過體質量檢測和病理切片來考察納米脂質體的毒性，發(fā)現(xiàn)6 mg/kg的藥物對機體沒有明顯的毒性。6 mg/kg是一個安全劑量，沒有不良反應。但是抗腫瘤效果并不好，而被包裹到納米脂質體里面后，不但沒有不良反應而且顯著提升了其抗癌效果。本研究認為這不僅跟納米脂質體的低毒性有關，而且跟納米脂質體的緩釋有關，可以將藥物緩慢的釋放到病灶部位，達到一個長時間作用的效果。這在臨床上對于腫瘤的治愈是一個非常重要的因素。

綜上所述，本研究中制備了L-DOC，具有方法簡單，包封率高，穩(wěn)定性好，體內體外抗癌效果好等特點，且沒有不良反應，在肝癌治療中有著廣闊的臨床應用前景。

[1] 陳建國.中國肝癌發(fā)病趨勢和一級預防[J].臨床肝膽病雜志，2012, 4(28)：256-260.

[2] Bosch FX,Ribes J,Borràs J.Epidemiology of primary liver cancer[C]//Seminars in liver disease,1998,19(3):271-285.

[3] Kaseb AO,Xiao L,Naguib R,et al.Abstract C26:Development and validation of a scoring system using insulin-like growth factor to assess hepatic reserve in hepatocellular carcinoma[J].Mol Cancer Ther,2013,12(11 Supplement):C26-C26.

[4] Zhang CZ,Zhang H,Yun J,et al.Dihydroartemisinin exhibits antitumor activity toward hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo[J].Biochem Pharmacol,2012,83(9):1278-1289.

[5] Minero VG,De Stefanis D,Costelli P,et al.In vitro and in vivo conditional sensitization of hepatocellular carcinoma cells to TNF-induced apoptosis by Taxol[J].Cell Cycle,2015,14(7):1090-1102.

[6] 康娟，吳小翔，張大志，等.載多西紫杉醇脂質微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破裂對人肝癌細胞增殖和凋亡影響的初步研究[J].重慶醫(yī)科大學學報，2014, 12(39)：1698-1702.

[7] Muthu MS,Kulkarni SA,Raju A,et al.Theranostic liposomes of TPGS coating for targeted co-delivery of docetaxel and quantum dots[J].Biomaterials,2012,33(12):3494-3501.

[8] Dakwar GR,Hammad IA,Popov M,et al.Delivery of proteins to the brain by bolaamphiphilic nano-sized vesicles[J].J Control Release,2012,160(2):315-321.

[9] Sun N,Meng Q,Tian A,et al.Nanoliposome-mediated FL/TRAIL double-gene therapy for colon cancer:in vitro and in vivo evaluation[J].Cancer Lett,2012,315(1):69-77.

[10] Barenholz Y Doxil?—the first FDA-approved nano-drug:lessons learned[J].J Control Release,2012,160(2):117-134.

[11] Tong L,Chen W,Wu J,et al.Folic acid-coupled nano-paclitaxel liposome reverses drug resistance in SKOV3/TAX ovarian cancer cells[J].Anti-Cancer Drug,2014,25(3):244-254.

[12] Dua JS,Rana AC,Bhandari AK.Liposome:methods of preparation and applications[J].Int J Pharm Stud Res,2012,3:14-20.

[13] 黃紅兵, 劉韜, 林子超，等，多西紫杉醇脂質體的制備及其在家兔體內的藥代動力學[J].癌癥，2007，26(12)：1287- 1291.

[14] Eldar-Boock A,Polyak D,Scomparin A,et al.Nano-sized polymers and liposomes designed to deliver combination therapy for cancer[J].Curr Opin Biotech,2013,24(4):682-689.

[15] Saw PE,Kim S,Lee I,et al.Aptide-conjugated liposome targeting tumor-associated fibronectin for glioma therapy[J].J Mater Chem B,2013,1(37):4723-4726.

[16] Li L,ten Hagen TLM,Hossann M,et al.Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy[J].J Control Release,2013,168(2):142-150.

[17] Marty M,Cognetti F,Maraninchi D,et al.Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment:The M77001 study group[J].J Clin Oncol,2005,23(19):4265-4274.

[18] Hanna N,Shepherd FA,Fossella FV,et al.Randomized phase III trial of pemetrexed versus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer previously treated with chemotherapy[J].J Clini Oncol,2004,22(9):1589-1597.

[19] Rein DT,Kurbacher CM,Breidenbach M,et al.Weekly carboplatin and docetaxel for locally advanced primary and recurrent cervical cancer:a phase I study[J].Gynecol Oncol,2002,87(1):98-103.

[20] Torchilin V.Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect[J].Adv Drug Delivery Rev,2011,63(3):131-135.

(編校：王冬梅)

Studies on the preparation of docetaxel nano-liposomes and its treatment on liver cancer cells in vivo and in vitro

MA You-long, QI Hai-yan, CAO Zhen-dong, HU Da-wei

(Department of Fourth Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

ObjectiveTo prepared the docetaxel nano liposome (L-DOC) for the therapy of liver cancer HepG2 cells in vitro and in vivo.MethodsThe film-ultrasonic dispersion method was used to prepare the L-DOC.The diameter and Zeta potential of L-DOC were determined by Nanosizer and the encapsulation efficiency was further measured.CCK-8 method was used to determine the cell viability of HepG2 cell after treating with various concentration of DOC and L-DOC respectively and the cell death type was detected by Flow cytometer.Next, we have studied the relative tumor volume change of tumor-bearing mice and the toxicity in vivo.ResultsThe average diameter of L-DOC was 104 nm and the Zeta potential was about -35.1 mV.The Zeta potential of L-DOC was almost unchanged after standing for 96 hours.The encapsulation efficiency of L-DOC was (71.2±1.6)%.The CCK-8 results showed that the cell viability was decreased after treating with various concentration of DOC and L-DOC, but the inhibition effect of L-DOC was better than that of DOC after treating with the same dose, especially for 20 μg/mL.It was found that the cell death was induced by apoptosis.The in vivo study results showed that 6mg/kg L-DOC could inhibit the tumor volume better than that of same dose of DOC.In addition, 6mg/kg L-DOC and DOC didn’t induce in vivo toxicity.ConclusionThe L-DOC is prepared by film-ultrasonic dispersion method which has small diameter, great biocompatibility.And it could inhibit the HepG2 cells in vitro and in vivo, especially for no in vivo toxicity.

docetaxel; nanoliposome; film-ultrasonic dispersion method; HepG2 cell; tumor therapy; apoptosis

河北省衛(wèi)生廳科研項目(20122127)

馬友龍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：肝癌靶向治療研究，E-mail：mayoulong@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)06-0043-05