曹江，俞松，呂欣

(貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 小兒矯形外科，貴州 遵義 563003)

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重組人血管內皮抑素對體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞增殖、細胞周期及VEGF、KDR/FIK-1表達的影響

曹江，俞松，呂欣

(貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 小兒矯形外科，貴州 遵義 563003)

目的 觀察重組人血管內皮抑制素對血管瘤內皮細胞增殖的抑制作用，探討其可能的作用機制。方法 體外培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞受到重組人血管內皮抑制素的作用后，采用MTT法檢測血管瘤內皮細胞增殖，流式細胞術檢測血管瘤內皮細胞周期，實時熒光定量PCR技術檢測VEGF、KDR mRNA在血管瘤內皮細胞中的表達。結果 重組人血管內皮抑制素各濃度組在24、48、72 h 3個作用時段對血管瘤內皮細胞抑制作用顯著(P<0.01)，并存在明顯的劑量依賴關系,IC50=355 μg/mL；重組人血管內皮抑制素(250 μg/mL)干預24 h后，G0/G1期細胞比例(94.23±1.66)%較對照組(90.63±1.14)%有明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF 與Flk-1 mRNA的表達相比對照組明顯降低(P<0.05)。結論 血管瘤內皮細胞周期受到重組人血管內皮抑制素抑制作用，同時VEGF、FLK-1的表達也受到其有效抑制。

血管瘤；血管內皮細胞；重組人血管內皮抑制素；增殖；細胞周期

血管瘤(hemangioma)是嬰幼兒最常見的良性腫瘤之一，發(fā)病率高達 5%～10%[1]，瘤體內注射藥物是目前治療血管瘤最安全、有效的方法。隨著血管生長因子和血管生長抑制劑研究的發(fā)展，許多抗腫瘤血管生長的藥物被用來治療血管瘤[2]，重組血管內皮抑素(rh-endostatin-16,YH-16)一種球蛋白，在自身靶細胞附著，獲取途徑為表達和純化結腸埃(舍利)希桿菌的第九氨基酸序列。最新研究表明，VEGF的信號激發(fā)直接影響血管內皮抑素的抗血管生成效應，血管內皮抑素對VEGF誘導的KDR/Flk-1的酪氨酸磷酸化存在直接抑制作用。因此，對血管內皮抑素和VEGF的信號通路關系進行深入的研究具有重要臨床意義。本研究將探討重組人血管內皮抑制素對體外培養(yǎng)的血管瘤血管內皮細胞的影響，及其對血管瘤內皮細胞周期的影響，并檢測VEGF、KDR在血管瘤內皮細胞中的表達情況，以此為血管瘤的局部藥物治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 從1例4個月嬰幼兒左肘部血管瘤中獲取血管瘤標本，瘤體具有巨大的體積和較快的增長速度，患兒具有嚴重的瘙癢癥狀，家屬強烈要求手術切除并同意征用標本。

1.2 主要試劑和儀器 重組人血管內皮抑制素(山東先聲麥得津生物制藥有限公司,國藥準字S20050088)、M199培養(yǎng)基(美國Sigma公司)、MTT試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)、ELISA試劑盒(美國RnD公司)。

流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司產品)、熒光定量PCR儀(CFX connect，BIO-RAD，美國)、全波長酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)、傳代和細胞接種 體外原代培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞，并向培養(yǎng)瓶中移入懸液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內放置。定期換液(3～4天1次)，待細胞匯合成片將瓶底鋪滿后開始傳代。用2 mL 0.25%胰蛋白酶將細胞消化，待細胞皺縮呈球形時將胰蛋白酶吸出來，將10 mL 10% M199培養(yǎng)基加入使消化終止。對細胞進行仔細吹打使其呈細胞懸液，按1:2的比例在培養(yǎng)瓶中接種，放置并培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，CO2體積分數、溫度和濕度分別為5%、37 ℃和飽和，待細胞將瓶底鋪滿后就可以再次傳代，傳代過程中應用0.25%胰蛋白酶。用0.25%胰蛋白酶消化貼壁血管瘤內皮細胞后向離心管內移送，同時將適量M199培養(yǎng)基加入稀釋到每管7 mL，反復細致地混勻、計數，使細胞密度為8×105個/mL左右。之后在3塊96孔培養(yǎng)板中接種細胞，將100 μL細胞懸液加入到每孔中，移入并培養(yǎng)于CO2體積分數為5%、溫度為37 ℃、濕度飽和的培養(yǎng)箱中進行24 h的培養(yǎng)。

1.4 四甲基偶氮唑鹽溶液法(MTT法)檢測血管瘤內皮細胞增殖 MTT檢測分為7組，分別為正常對照組、重組血管內皮抑制素處理組：15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL組。具體操作如下，在1000 μL無血清M199培養(yǎng)基中加入500 μL重組血管內皮抑制素稀釋成所需濃度500 μg/mL，然后將其稀釋成6種不同濃度，即15.625、31.25、62.5、125、250 μg/mL，配置過程中嚴格依據倍比稀釋法。吸盡96孔板中培養(yǎng)基后，將上述6種不同濃度100 μL重組血管內皮抑制素加入各孔，每個濃度下8個復孔，設無細胞的空白孔和沒有加藥物的對照孔，然后分別于給藥后24、48、72 h進行MTT實驗。

取20 μL的5 mg/mL MTT加入到96孔板每孔中，在恒溫孵箱中進行5 h的培養(yǎng)，CO2體積分數、溫度分別為5%、37 ℃，培養(yǎng)終止，并將150 μL二甲基亞砜(DMSO)加入到每孔中，在酶標儀上振蕩10min，在490 nm波長處測定各孔吸光度(OD值)。每組進行3次重復，取平均A值。用下列公式計算出各藥物濃度的細胞存活抑制率：抑制率=(1-加藥細胞OD值/ 對照細胞A值)×100%。然后通過藥物濃度和相應抑制率計算出半抑制率IC50。

1.5 流式細胞技術檢測血管內皮抑制素對血管瘤內皮細胞周期的影響 流式細胞術分對照組與干預組，其中干預組采用MTT實驗最接近IC50的重組血管內皮抑制素濃度組進行。使用普通離心機調整轉速1 000 r/min，離心5 min后棄上清；用PBS緩沖液洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min后棄上清；在離心好的細胞中加入體積分數為70%的冷乙醇500 μL固定，-20 ℃保存；1000 r/min，離心5 min，去乙醇后再予PBS緩沖液洗滌細胞2次；加入50 μL RNase-A，并在37 ℃水浴箱中孵育30 min以完全裂解RNA；每管中加入PI染色液150 μL并輕輕吹打混勻，4 ℃避光孵育30 min。

1.6 熒光定量PCR檢測血管瘤內皮細胞中VEGF、KDR mRNA表達 Trizol法提取血管瘤內皮細胞總RNA，紫外分光光度計上分別測定其260 nm和280 nm處的OD值(以DEPC水調零)，以1.8≤OD260/OD280≤2.2認為RNA 純度符合要求。將提取的RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄體系為20 μL，包括5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅠ 0.5 μL，總RNA 1 μg，用水補足至20 μL，條件是37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。隨后進行實時定量PCR擴增，體系20 μL如下，SYBR Green SupermixTM10 μL，cDNA溶液2 μL，PCR Primer 1.6 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL，反應條件為95 ℃，3 min預變性；95 ℃，10 s變性；60 ℃×1 min退火，40循環(huán)；溶解曲線分析55 ℃ 10 s，80 Cycles。引物由大連寶生物技術有限公司設計合成，VEGF 上游5′-AGGCCAGCACATAGGAGAGA-3′， 下游3′-TTTCTTG-CGCTTTCGTTTTT-5′，擴增片段長度為133bp；Flk-1上游5′-GTGACCAACATGGAGTCGTG-3′，下游3′-TGCTTCACAGAAG-ACCATGC-5′，擴增片段長度為218bp；β-actin上游5′-GGACTTC-GAGCAAGAGATGG-3′，下游3′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-5′，擴增片段長度為234 bp。

2 結果

2.1 血管瘤內皮細胞增殖受到不同濃度的重組血管內皮抑制素的影響 6個濃度組的血管瘤內皮細胞均受到重組血管內皮抑制素的一定的抑制作用，抑制率隨濃度和時間的增加逐漸上升，對細胞增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增大，具有劑量依賴抑制關系，IC50=355 μg/mL。

表1 不同濃度的重組血管內皮抑制素對血管瘤內皮細胞增殖的影響±s，n=8)Tab.1 Effects of different concentrations of recombinant endostatin on the proliferation of vascular tumor endothelial cells ±s，n=8)

*P<0.05,**P<0.01，與正常對照組比較，compared with control group ；△P<0.05,△△P<0.01，與15.625 μg/mL組比較，compared with 15.625 μg/mL group

2.2 流式細胞技術檢測血管內皮抑制素對血管瘤內皮細胞周期的影響 IC50=355 μg/mL，因此選取250 μg/mL濃度組進行干預，重組人血管內皮抑制素干預24 h后G0/G1期細胞比例(94.23±1.66)%，較對照組(90.63±1.14)%，顯著增多(t=-3.09，P<0.05)。

圖1 血管內皮抑制素對血管瘤內皮細胞周期的影響±s,n=3)Fig.1 Effect of endostatin on the cell cycle of vascular tumor endothelial ±s,n=3)

2.3 Real-time PCR檢測結果 重組人血管內皮抑制素(250 μg/mL)作用后的細胞中VEGF與Flk-1 mRNA的表達明顯降低(P<0.05)。

表2 Real-time PCR檢測各組p57KIP2 mRNA的表達情況Tab.

#P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

現階段，臨床在治療腫瘤的過程中已經極為廣泛地應用了重組人血管內皮抑素[3-6]，其是一種內源性血管生成抑制劑。如果血管瘤內皮細胞處于增殖狀態(tài)，那么YH-16能對其進行特異抑制，但是如果內皮細胞處于靜止狀態(tài)或細胞起源于非內皮細胞，那么YH-16則不會對其造成影響，在抑制新生血管中有其獨特優(yōu)勢，其通過在內皮抑素的N端加上9個氨基酸殘基序列，使其較內皮抑素蛋白對酶、酸、熱的穩(wěn)定性更佳，據研究重組人血管內皮抑素可靶向一部分的人類基因組血管生成調節(jié)基因，抑制血管內皮的生長和遷移，促進其凋亡，以顯著減少腫瘤組織內生成新血管，以此發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉移的作用[7]。臨床前期相關醫(yī)學學者研究顯示，其在血管內皮細胞直接作用，能夠對新生血管進行有效抑制，療效及安全性均較好[8-9]。目前已有研究報道重組人血管內皮抑素可以通過影響血管瘤的凋亡進而導致血管瘤消退[10-11]。但是否通過影響細胞周期來導致血管瘤消退未見相關報道。

VEGF屬于一種細胞因子，是一類糖蛋白，分子量為34～45KD，具有強大的功能，且能夠產生多種生物學效應，Ferrarra在1989年將其分離純化出來，主體為牛垂體濾泡星狀細胞培養(yǎng)液，在血小板衍生生長因子家族中占有極為重要的地位，具有高度保守的序列，在人和動物體內的大腦、肝臟、胰腺等組織中廣泛分布。VEGF具有多方面的作用，如為血管內皮細胞增殖及血管支持物生成提供良好的前提條件，促進血管通透性的增加，對腫瘤細胞的凋亡進行有效抑制等。VEGF因其能促進血管生成，故在腫瘤生長中必不可少。FLK-1結構為：細胞外7個相同的免疫球蛋白區(qū)，一個跨膜區(qū)和細胞內一個酪氨酸激酶區(qū)，FLK-1與VEGF、VEGF-B和PIGF有高度親和力結合。VEGF在多種腫瘤組織中如胃癌、大腸癌及乳腺癌中都發(fā)現VEGF的表達與組織分化、淋巴結轉移和早期死亡密切相關[12-13]。近年來，阻斷VEGF作用的各種抑制劑有了長足的發(fā)展，其作用機制包括：①抑制VEGF于受體直接結合；②抑制VEGF的合成；③抑制VEGF的信號轉導[14]；而有研究發(fā)現重組人血管內皮抑素可以通過抑制VEGF的合成，進而導致腫瘤的消退，但重組人內皮細胞是否在血管瘤中同樣通過抑制VEGF及其受體的表達進而通過影響其周期而導致血管瘤消退，未見相關報道。本實驗通過利用重組人血管內皮抑制素干預血管瘤周期，并同時利用PCR檢測VEGF及其受體FLK-1的表達，重組人血管內皮抑制素干預24 h后，VEGF、FLK-1的表達相比對照組，差異有統(tǒng)計學意義。提示：重組人血管內皮抑制素可能通過抑制VEGF的表達而抑制血管瘤的周期進而導致血管瘤消退。

本研究結果表明，YH-16各濃度組在24、48及72 h 3個作用時段對血管瘤內皮細胞抑制作用顯著(P<0.01)，并存在明顯的劑量依賴關系；重組人血管內皮抑制素干預24 h后，G0/G1期細胞比例(94.23±1.66)%較對照組(90.63±1.14)%有明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF的表達相比對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；FLK-1相比對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，充分說明了血管瘤內皮細胞周期受到重組人血管內皮抑制素抑制作用，同時VEGF、FLK-1的表達也受到其有效抑制，值得臨床充分重視。

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(編校：譚玲)

Effects of recombinant human endostatin on proliferation, cell cycle and expression of KDR/FIK-1 and VEGF in hemangioma endothelial cells in vitro

CAO Jiang, YU Song, LV Xin

(Department of Pediatric Orthopedic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China)

ObjectiveTo observe inhibitory effect of recombinant human endostatin on the proliferation of vascular tumor endothelial cells and to investigate its possible mechanism.MethodsHemangioma endothelial cells were cultured in vitro and different concentrations of endostatin on hemangioma endothelial cell proliferation inhibition were detected by MTT method.Effect of recombinant human endostatin on endothelial cell cycle was detected by flow cytometry.The expression of VEGF, KDR mRNA in hemangioma endothelial cell were detected by Real-time RT PCR.ResultsRecombinant human endostatin concentrations in 24 h, 48 h and 72 h after three period during which the hemangioma endothelial cells inhibited significantly(P<0.01), and there was a clear dose dependence,IC50 was 355 μg/mL.Recombinant human vascular endostatin(250 μg/mL) intervented for 24 hours, the proportion of cells in G0/G1 phase(94.23±1.66)%, compared with control group (90.63±1.14)%, had significantly difference (P<0.05).Compared with the control group, the difference of the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was statistically significant (P<0.05) as well as Flk-1 (P< 0.05).ConclusionRecombinant human endostatin does not only have inhibitory effect of hemangioma endothelial cell cycle, but also can inhibit the expression of VEGF and FLK-1.

hemangioma; vascular endothelial cells; recombinant human endostatin; proliferation; cell cycle

國家自然科學基金(No.81460476)

曹江，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：小兒血管瘤，E-mail: 448084715@qq.com。

R53

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1005-1678(2015)06-0031-04