孫桂霞，徐世文

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

雞源空腸彎曲菌調(diào)查與耐藥性分析

孫桂霞，徐世文*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

空腸彎曲菌是嚴(yán)重危害人畜健康的病原菌，為了解哈爾濱市肉雞源性空腸彎曲菌流行病學(xué)和耐藥性，研究調(diào)查哈爾濱市周邊肉雞場空腸彎曲菌感染狀況，通過耐藥性和耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)雞場平均感染率為35.67%，對13種抗生素均有不同程度耐藥性，四環(huán)素和氨芐西林鈉達(dá)100%，存在多重耐藥性，最高耐藥譜達(dá)11個(gè)，檢出菌株率為14.95%。57.94%菌株攜帶tetA、tetB、tetC、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1基因，檢出率分別為57.94%、66.36%、28.97%、42.99%、55.14%和8.41%，而tetD和blaSHV-1基因未檢出。結(jié)果表明，哈爾濱市肉雞場空腸彎曲菌感染普遍，存在多重耐藥并攜帶多種耐藥基因，為有效防治空腸彎曲菌病提供依據(jù)。

肉雞；空腸彎曲菌；耐藥性；耐藥基因

空腸彎曲菌是常見的人獸共患病原菌。人類除引起腸炎外，還可引起中毒、肝炎、關(guān)節(jié)炎和格林-巴利綜合癥等免疫損傷性疾病[1-2]。獸醫(yī)臨床上常見癥狀是腹瀉，此外也見于乳房炎、不孕、流產(chǎn)和禽類肝炎[3]。世界衛(wèi)生組織已將該病列為最常見的食源性傳染病之一，我國在上海、北京、福建等地多次報(bào)道經(jīng)食物感染該菌引發(fā)的疾病[4]。動(dòng)物產(chǎn)品是人感染空腸彎曲菌主要來源，雞肉和雞蛋是主要消費(fèi)動(dòng)物性食品。雞是空腸彎曲菌病重要傳染源，消費(fèi)雞肉與空腸彎曲菌的流行緊密相關(guān)[5]。開展肉雞空腸彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查，掌握其流行情況，采取相應(yīng)方法預(yù)防尤為重要。本研究調(diào)查哈爾濱市5個(gè)大型雞場肉雞空腸彎曲菌感染情況，通過耐藥性試驗(yàn)和耐藥基因檢測，為了解哈爾濱市不同雞場空腸彎曲菌流行分布狀況，闡明其流行規(guī)律、耐藥性以及預(yù)測其流行趨勢和有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣本及來源

樣本采自哈爾濱市5個(gè)肉雞場，每個(gè)雞場采集28、42日齡肉雞各30份肛試子，共300份，樣品采集后置于運(yùn)送培養(yǎng)基中，于24 h內(nèi)送達(dá)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，并立即檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

改良Camp-BAP培養(yǎng)基和改良布氏肉湯購自青島海博有限責(zé)任公司；氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、厄他培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、替吉環(huán)素和多黏菌素，購自中國藥品生物制品監(jiān)督所；Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、10×PCR buffer、25 mmol·L-1MgCl2、Dntp mixture（各2.5 mmol·L-1）、DNA Marker DL2000等購自寶生物工程（大連）有限公司，其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.2 方法

1.2.1 空腸彎曲菌分離培養(yǎng)與鑒定

空腸彎曲菌分離鑒定按GB/T 4789.9-2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[6]。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

按照微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)檢測[7]。

1.2.3 耐藥基因檢測

根據(jù)GenBank已發(fā)表耐藥基因序列，參考張博試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]，對空腸彎曲菌進(jìn)行8種耐藥基因PCR檢測，其中包括四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetB、tetC和tetD）和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaSHV-1、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1）。引物由上海生工合成，如表1所示。PCR體系取模板cDNA 2.0 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各1 μL，混合Tag酶9.5 μL，加入滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃30 s，72℃30 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，于3.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以檢測擴(kuò)增效果。

表1 擴(kuò)增目的基因引物序列及目的片段長度Table 1Primer sequence and amplification length of destination fragment

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞場空腸彎曲菌檢出率

按照國標(biāo)空腸彎曲菌檢驗(yàn)（GB/T 4789.9-2008）方法[6]，通過對300份病料分離培養(yǎng)，共鑒定出陽性病料107份，陽性率為35.67%，但不同雞場污染率不同，最高檢出率為78.33%（47/60），最低檢出率為8.33%（5/60）。

2.2 空腸彎曲菌耐藥性檢測結(jié)果

由表2可知，總耐藥率最高為四環(huán)素（92.52%），最低為多粘菌素（5.61%）。但各雞場耐藥性差異較大，如E場對四環(huán)素、氨芐西林耐藥率達(dá)100%，而D場對慶大霉素耐藥率為100%。

由表3可知，分離出的空腸彎曲菌存在多重耐藥性，在檢測的13種抗生素藥物中，最高耐藥譜達(dá)到11個(gè)，檢出菌株率為14.95%。多粘菌素具有較高敏感性。

2.3 耐藥基因的檢測結(jié)果

由表4可知，分離出的空腸彎曲菌中有57.94%攜帶tetA基因，攜帶tetB基因?yàn)?6.36%，攜帶blaNDM-1基因檢出最低，為8.41%。而tetD和blaSHV-1基因未檢出。

表2 空腸彎曲菌分離株耐藥率分析結(jié)果Table 2Results about the resistant rate of Campylobacter jejuni separate strains

表3 空腸彎曲菌耐藥譜分析結(jié)果Table 3Antibiogram results of Campylobacter jejuni

表4 耐藥基因陽性菌株數(shù)量及檢出率Table 4Number and detection rate of positive strains resistant genes

3 討論與結(jié)論

3.1 雞源空腸彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果分析

空腸彎曲菌是多種動(dòng)物空腸中多見條件性致病菌，該菌在腸道內(nèi)大量繁殖，通過糞便排到體外，污染食物、水源，常可引起人類感染。流行病學(xué)調(diào)查顯示，雞具有很高的帶菌率，不同地區(qū)帶菌率存在明顯差異。廣東地區(qū)雞、鴨和鵝空腸彎曲菌帶菌率分別為7.93%、2.46%和4.16%[9]。貴陽市雞、豬空腸彎曲菌帶菌率分別為17.33%、12.0%[10]。調(diào)查結(jié)果顯示，哈爾濱市5個(gè)肉雞場中空腸彎曲菌檢出率平均為35.67%，最高檢出率為78.33%（47/ 60），最低檢出率為8.33%，遠(yuǎn)高于河南0.6%、江蘇7.6%、華東地區(qū)8.96%、山東30.8%的分離率，低于上海43.2%、安徽45.2%、浙江30.4%等地的分出率[11-15]。研究表明，雞群攜帶空腸彎曲菌最高可達(dá)100%[16]。

3.2 雞源空腸彎曲菌耐藥性分析

四環(huán)素類和β內(nèi)酰胺類藥物是獸醫(yī)臨床上常用的抗生素，隨該藥物大量使用，細(xì)菌耐藥問題嚴(yán)重，已引起關(guān)注。Reina和Bardon研究證實(shí)，空腸彎曲菌對壯觀霉素、慶大霉素耐藥性為1.0%～9.4%[17-18]，Luangtongkum等研究表明，空腸彎曲菌對紅霉素耐藥率為80%[19]，Jain等報(bào)道，空腸彎曲菌對四環(huán)素耐藥率僅為26.5%[20]。韓新鋒等對成都市及雅安市肉雞生產(chǎn)鏈調(diào)查表明，空腸彎曲菌分離株對環(huán)丙沙星、左氟沙星、四環(huán)素和克林霉素耐藥率較高，分別為94.44%、93.89%、91.67%和78.33%，對紅霉素（20.00%）、鏈霉素（20.56%）、慶大霉素（17.78%）、氟苯尼考（12.22%）呈現(xiàn)不同耐藥率[21]。本試驗(yàn)調(diào)查顯示，分離空腸彎曲菌株對四環(huán)素耐藥率最高（92.52%），其次為環(huán)丙沙星（84.11%），再次為氨芐西林耐藥率為80.37%。這與國內(nèi)報(bào)道不完全一致[22-23]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌存在多重耐藥譜，與多數(shù)報(bào)道一致[24]，表明臨床上存在抗生素濫用。

臺(tái)灣、泰國和西班牙的研究資料顯示，空腸彎曲菌氟喹諾酮抗性比率分別是56.9%、84%和75%～88%[25-27]。耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，分離株空腸彎曲菌普遍攜帶耐藥基因。Andersen等調(diào)查丹麥空腸彎曲菌耐藥性，研究結(jié)果表明，彎曲桿菌攜帶多種耐藥基因，如tetA、tetB、blaCTX-M和blaTEM等[28]。姜毅等研究發(fā)現(xiàn)，對環(huán)丙沙星耐藥的15株空腸彎曲菌均檢測出在gyrA基因257位發(fā)生點(diǎn)突變[24]。Kurincic等證實(shí)CmeABC外排泵在彎曲桿菌固有紅霉素耐藥性和獲得低水平紅霉素耐藥性中的作用[29]。Ge等證實(shí)，cmeB失活可影響空腸彎曲菌對氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素的敏感性[30]?？漳c彎曲菌分離菌群對喹諾酮類有更高的耐藥水平，其有兩個(gè)突變，一個(gè)在gyr的Th-r86上，另外在拓?fù)洚悩?gòu)酶IV殘基的Arg-139上[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，分離株空腸彎曲菌耐藥基因攜帶率較高，tetB為66.36%，tetA為57.94%，blaTEM為55.14%，blaCTX-M為42.99%，表明所調(diào)查雞場感染的空腸彎曲菌普遍攜帶耐藥基因，結(jié)論可為雞場防治空腸彎曲菌病、有效消除耐藥性和耐藥基因傳播提供理論依據(jù)。

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Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler/

SUN Guixia,XU Shiwen
(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Campylobacter jejuniis a kind of pathogenic bacteria which cause serious damage to the human and animal health.To understand the epidemiological and drug resistance ofCampylobacter jejuniin broiler of Harbin,the present study investigated the infection status ofCampylobacter jejuniin broiler in Harbin and its surrounding area,meanwhile,detected the drug resistance and expression of resistant genes. The results showed that the average infections of chicken farms were 35.67%.Campylobacter jejunihad different degrees of antibiotic resistance to 13 kinds of antibiotics,which the antibiotic resistance of tetracycline and ampicillin sodium were 100%,while there were multiple drug resistance.The highest drug-resistant spectrums were 11,while the detection rate of bacterial strain was 14.95%.57.94%bacterial strain containedtetA,tetB,tetC,blaCTX-M,blaTEMandblaNDM-1 genes,that the detection rate were 57.94%,66.36%,28.97%,42.99%,55.14%and 8.41%,respectively.However,the present study didn't detecttetDandblaSHV-1 genes.The results showed that the infections ofCampylobacter jejuniin chicken farms of Harbin were occured commonly,while there were multiple drug resistance.It provided the basis for effective prevention and treatment ofCampylobacter jejuni.

broiler;Campylobacter jejuni;drug resistance;resistance genes

S831

A

1005-9369（2015）09-0064-05

時(shí)間2015-9-23 9：38：10[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.012.html

孫桂霞,徐世文.雞源空腸彎曲菌調(diào)查與耐藥性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(9):64-68.

Sun Guixia,Xu Shiwen.Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):64-68.(in Chinese with English abstract)

2015-04-07

環(huán)保部公益性項(xiàng)目(200909043)

孫桂霞（1966-），女，獸醫(yī)師，博士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品安全。E-mail：746930375@qq.com

*通訊作者：徐世文，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾笄轄I養(yǎng)代謝病與中毒病。E-mail：shiwenxu@neau.edu.cn