張紅　吳海波　李寐華　熊韜　王廣智　伊鴻平

摘 要： 為達(dá)到選育甜酸味品系、縮短育種周期、提高選擇準(zhǔn)確率的目的，本研究基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（SLAF-seq）的選擇性基因型鑒定和集群分離分析（Super-BAS），結(jié)合生物信息學(xué)方法，以‘風(fēng)味4號(hào)甜瓜F2群體甜味、酸味、不甜不酸3個(gè)極端表型群體為試驗(yàn)材料，精細(xì)定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因并開(kāi)發(fā)功能性標(biāo)記。結(jié)果顯示：（1）將甜瓜含糖量、酸度性狀定位在雙親基因組；（2）獲得1個(gè)含糖量性狀相關(guān)候選基因，3個(gè)酸度性狀相關(guān)候選基因；（3）針對(duì)候選基因開(kāi)發(fā)出1個(gè)含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。本研究開(kāi)發(fā)的功能性分子標(biāo)記為甜瓜品質(zhì)性狀基因的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的標(biāo)記基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 含糖量； 酸度； 精細(xì)定位； 功能分子標(biāo)記

Abstract： SLAF-seq-based selective genotyping and bulked segregant analysis（Super-BSA），together with bioinformatic methods were performed in three extreme phenotypes populations（sweetness，acidity and neither sweet nor sour） from the F2 population of a flavorful melon（Cucumis melo L.） ‘Fengwei No. 4； fine mapping of its genes related to sugar content and acidity traits was achieved and functional markers were developed. Results showed that：（i） both sugar content and acidity traits were mapped in parental genome；（ii） one sugar content trait-related candidate gene and three acidity trait-related genes were obtained；（iii） one sugar content（SLAF18745-S01） and three acidity （SLAF36334-S02，SLAF50072-S03 and SLAF31212-S04）trait-related gene functional molecular markers were developed based on the candidate genes. In conclusion，the functional molecular markers developed in this study provide an important marker foundation for molecular marker-assisted selection of quantitative trait loci of melons，which can reduce breeding cycles and improve the accuracy of selection.

Key words： Melon； Sugar content； Acidity； Fine mapping； Functional molecular markers

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫蘆科甜瓜屬，是一種重要的園藝作物，我國(guó)甜瓜的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。甜瓜是一種高多態(tài)性物種，含有各種不同果實(shí)風(fēng)味的基因型[1-3]。

大多數(shù)果實(shí)的風(fēng)味由糖、有機(jī)酸及果實(shí)特征香氣組成，糖含量是影響甜瓜果實(shí)品質(zhì)的主要因子[4]，蔗糖是甜瓜果實(shí)成熟所積累的主要成分[5-7]。甜瓜栽培種果實(shí)有機(jī)酸含量很低，但甜瓜種（Cucumis melo）中存在高有機(jī)酸含量的遺傳變異[8-11]。近年來(lái)，育成了具有獨(dú)特酸甜味的甜瓜栽培種[12-14]。甜、酸等風(fēng)味的變化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受一系列相關(guān)基因的影響和調(diào)控[15]。定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因并開(kāi)發(fā)功能性標(biāo)記，為提高甜瓜果實(shí)品質(zhì)性狀選育效率及甜瓜分子育種提供思路。在現(xiàn)有甜瓜育種實(shí)踐中，對(duì)含糖量、酸度等風(fēng)味性狀大多是通過(guò)表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，致使育種周期長(zhǎng)，效率低，制約著甜瓜品種改良的進(jìn)程[16]。分子標(biāo)記輔助選擇，尤其是對(duì)與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的功能性分子標(biāo)記的選擇可極大提高選擇的效率，加速遺傳改良[17-18]。

現(xiàn)有技術(shù)中，功能性分子標(biāo)記作為與表型相關(guān)的由功能基因序列中功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）開(kāi)發(fā)而成的分子標(biāo)記[19]，其開(kāi)發(fā)必須具備以下2個(gè)條件：（1）有確定功能的候選基因并已知等位基因的序列信息；（2）在多個(gè)材料中對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行序列分析，結(jié)合性狀和基因序列信息進(jìn)行基于連鎖不平衡（LD）的關(guān)聯(lián)分析[20]。功能基因定位是功能性分子標(biāo)記發(fā)掘的基礎(chǔ)，目前功能基因定位常用的方法有基于傳統(tǒng)遺傳圖譜定位與集群分離分析法（BSA）?；趥鹘y(tǒng)遺傳圖譜對(duì)甜瓜糖、酸性狀進(jìn)行了QTL定位[8，21-23]，但該方法的周期長(zhǎng)、密度低、成本高；而集群分離分析法（BSA）可快速、有效尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，但混池個(gè)數(shù)有限，一般不超過(guò)10個(gè)，關(guān)聯(lián)分析假陽(yáng)性幾率大，標(biāo)記密度低。近年來(lái)發(fā)展的選擇性基因型鑒定和集群分離分析（Super BSA），利用SLAF-seq（Specific Location Amplified Fragments sequence，特定位置擴(kuò)增片段測(cè)序）[24]，選擇均勻分布在整個(gè)基因組、且避開(kāi)重復(fù)序列區(qū)域的特異片段進(jìn)行高深度測(cè)序，通過(guò)比較SNP標(biāo)記的不同基因型在2個(gè)混池中出現(xiàn)頻率的差異，確定與性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記。Super BSA分子標(biāo)記密度高，30～200個(gè)體的混池，保證了基因定位的功效和準(zhǔn)確性。同時(shí)，由于SLAF標(biāo)簽中的多態(tài)性位點(diǎn)已經(jīng)定位在基因組上，可以根據(jù)基因組的位置使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記。這些近幾年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型，具有重要的意義，但是至今未見(jiàn)開(kāi)展甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記方面的研究和報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖甜瓜自交系‘壽星為母本、高新果味自交系‘新果味為父本進(jìn)行雜交，得到雜種F1即‘風(fēng)味4號(hào)；由雜種F1自花授粉獲得F2代群體，對(duì)父母本、F1及每個(gè)F2代單株果實(shí)的含糖量、酸度利用PAL-1糖度測(cè)定儀（日本ATATO公司）、STARTER300便攜式pH計(jì)[奧豪斯儀器（上海）有限公司]測(cè)量并結(jié)合品嘗進(jìn)行鑒定。

1.2 含糖量、酸度性狀相關(guān)基因定位

通過(guò)CTAB法[25]提取每份材料的基因組DNA，將5株父本、5株母本及甜味、酸味、不甜不酸各50個(gè)單株的基因組DNA等量混合，形成5個(gè)混池。利用酶切預(yù)測(cè)軟件SLAF_Predict（北京百邁客公司開(kāi)發(fā)）分析甜瓜基因組，分別對(duì)5個(gè)混池基因組進(jìn)行雙酶切，混池中各個(gè)樣品同一位點(diǎn)處的DNA片段序列經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、Illumina GA IIx（Illumina，San Diego，CA，USA）測(cè)序。Blat比對(duì)軟件對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行聚類(lèi)、Cap snp 軟件檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，獲得多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽[26]。

選擇不甜不酸混池中a/b > 3或者b/B > 3的純和標(biāo)記對(duì)含糖量、酸度性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)定位。分別計(jì)算群體ac（不甜不酸）與ab（含糖量）之間和ac（不甜不酸）與aa（酸度）之間來(lái)源于不同基因型的差異比值，得到差異標(biāo)記。將與含糖量、酸度性狀關(guān)聯(lián)的差異標(biāo)記通過(guò)blat軟件比對(duì)，在雙親基因組上定位，注釋標(biāo)記物理位置所在的基因，獲得與含糖量、酸度性狀相關(guān)的功能基因，挑選出處于功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽。

1.3 功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及穩(wěn)定性檢測(cè)

利用Primer Premier 5.0軟件，對(duì)功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽設(shè)計(jì)引物，對(duì)甜味、酸味、不甜不酸及酸甜味材料基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系25 μL，含100 ng·μL-1模板DNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、5 U·μL-1 DNA Taq 酶0.3 μL、ddH2O 17.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，45～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用6% PAGE膠銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴(kuò)增產(chǎn)物，而在不甜不酸單株中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

母本‘壽星味甜（TSS >12，pH>6），父本‘新果味味酸（TSS?8，pH ?5），F(xiàn)1‘風(fēng)味4號(hào)酸甜味（TSS>12 ，pH?5），F(xiàn)2群體分離出4種類(lèi)型，即甜味（TSS >12，pH>6）、酸味（TSS?8，pH ?5）、酸甜味（TSS >12，pH?5）和不甜不酸（TSS?8，pH>6）。采用Super-BSA技術(shù)，父本、母本及3個(gè)混池共獲得12 438 270 reads。深度大于10x以上的基因型的SLAF標(biāo)簽 46 087個(gè)，整體平均深度達(dá)161.81x，多態(tài)性的SLAF 標(biāo)簽4 480個(gè)，分別得到與含糖量性狀相關(guān)差異標(biāo)記114個(gè)、酸度性狀相關(guān)差異標(biāo)記215個(gè)。其中，連續(xù)3個(gè)以上滿足分離比例的標(biāo)記所在的區(qū)域即為關(guān)聯(lián)區(qū)域，得到6個(gè)含糖量性狀相關(guān)候選區(qū)域，區(qū)域內(nèi)共有13個(gè)差異標(biāo)記，23個(gè)酸度性狀相關(guān)候選區(qū)域，區(qū)域內(nèi)共有48個(gè)差異標(biāo)記。13個(gè)甜味性狀差異標(biāo)記中1個(gè)被定位在雙親基因組上、并處在功能基因的外顯子中；48個(gè)酸度性狀差異標(biāo)記中3個(gè)定位在雙親基因組上并處在功能基因的外顯子中（表1）。

對(duì)1個(gè)含糖量性狀相關(guān)功能基因及3個(gè)酸度性狀相關(guān)功能基因的SLAF標(biāo)簽的多態(tài)性序列，利用Primer Premier 5.0軟件各設(shè)計(jì)引物1對(duì)，引物序列見(jiàn)表2，以父本、母本、甜味、酸味、不甜不酸味單株為材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以發(fā)展含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴(kuò)增產(chǎn)物，片段分別為249、66、283、274 bp，而在不甜不酸單株中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。結(jié)果成功發(fā)現(xiàn)了1個(gè)含糖量性狀相關(guān)功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01（圖1），3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02（圖2）、SLAF50072-S03（圖3）和SLAF31212-S04（圖4）。

進(jìn)一步對(duì)F1、F2單株材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證獲得的含糖量、酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的穩(wěn)定性。含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01在F1及F2中甜味、酸甜味材料中擴(kuò)增出249 bp條帶，而F2中不酸不甜、酸味材料中沒(méi)有出現(xiàn)（圖5）。酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03、SLAF31212-S04只是在F1及F2中酸味、酸甜味材料中擴(kuò)增出66、283、274 bp條帶，而F2中不甜不酸、甜味材料中沒(méi)有出現(xiàn)（圖6、圖7、圖8），說(shuō)明4個(gè)功能性分子標(biāo)記是穩(wěn)定的。

3 討 論

前人基于傳統(tǒng)遺傳圖譜對(duì)甜瓜糖、酸性狀進(jìn)行了QTL定位[8，21-23]，但并未進(jìn)行分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。Super BAS是利用生物信息學(xué)、高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)30～200個(gè)體較大規(guī)模的混池，10 000+SNP高密度掃描，獲得覆蓋全基因組的海量序列信息，從而保證了基因定位的功效和準(zhǔn)確性。目前利用高通量測(cè)序結(jié)合集群分離分析法（BSA）已成功精細(xì)定位水稻真菌稻瘟病[27]、小麥高籽粒蛋白含量基因GPC-B1[28]。本研究利用Super BSA技術(shù)，通過(guò)對(duì)具有不同甜味、酸味性狀親本及極端子代DNA混池的全基因組DNA標(biāo)記高密度掃描，精細(xì)定位甜瓜含糖量、酸度性狀區(qū)域，開(kāi)發(fā)出1個(gè)含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。

通過(guò)應(yīng)用甜瓜果實(shí)甜味、酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記，在不同世代間重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，為甜瓜品質(zhì)性狀基因的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的標(biāo)記基礎(chǔ)，可簡(jiǎn)便、快速的應(yīng)用于育種實(shí)踐，從而將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型。對(duì)于甜瓜含糖量、酸度性狀的改良和改善具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義，也為分子育種、系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)資源鑒定中分子標(biāo)記的篩選提供了一種重要的開(kāi)發(fā)途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] Kirkbride J H. Biosystematic monograph of the genus Cucumis（Cucurbitaceae）： botanical identification of cucumbers and melons[M]. North Carolina，USA： Parkway，1993.

[2] Stepansky A，Kovalski I，Perl-treves R. Intraspecific classification of melons（Cucumis melo L.）in view of their phenotypic and molecular variation[J]. Plant Systematics and Evolution，1999，217（3/4）： 313-332.

[3] Tanaka K，Nishitani A，Akashi Y，et al. Molecular characterization of South and East Asian melon，Cucumis melo L.，and the origin of Group Conomon var. makuwa and var. conomon revealed by RAPD analysis[J]. Euphytica，2007，153（1/2）： 233-247.

[4] Yamaguchi M，Hughes D L，Yabumoto K，et al. Quality of cantaloupe muskmelons： variability and attributes[J]. Scientia Horticulturae，1977，6（1）： 59-64.

[5] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，中國(guó)園藝學(xué)會(huì)西甜瓜專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，中國(guó)園藝學(xué)會(huì)西甜瓜協(xié)會(huì).中國(guó)西瓜甜瓜[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000： 435-436.

[6] Burger Y，Schaffer A A. The contribution of sucrose metabolism enzymes to sucrose accumulation in Cucumis melo[J]. Journal of the American Society for Horticultural Scienc，2007，132（5）： 704-712.

[7] Schaffer A A，Madore M，Pharr D M. Cucurbits. In： Zamski E，Schaffer AA（eds） Photoassimilate distribution in plants and crops[M]. New York：Marcel Dekker，1996： 729-757.

[8] Cohen S，Tzuri G，Harel-Beja R，et al. Co-mapping studies of QTLs for fruit acidity and candidate genes of organic acid metabolism and proton transport in sweet melon（Cucumis melo L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（2）： 343-353.

[9] Burger Y，Paris H，Cohen R，et al. Genetic diversity of Cucumis melo[J]. Horticultural Reviews，2009，36： 165-198.

[10] Daniel Manriquez，Isian E S，F(xiàn)rancisco B F. Two highly divergent alcohol dehydrogenases of melon exhibit fruit ripening-specific expression and distinct biochemical characteristics[J]. Plant Molecular Biology，2006，61（4/5）： 675-685.

[11] Kubicki B. Inheritance of some characters in muskmelons（Cucumis melo） [J]. Genet Polon，1962，3： 265-274.

[12] Burger Y，Saar U，Distefeldi A，Katzir N，et al. Development of sweet melon（Cucumis melo） genotypes combining high sucrose and organic acid content[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2003，128（4）： 537-540.

[13] 吳明珠，伊鴻平，馮炯鑫，等. 新疆厚皮甜瓜輻射誘變育種效果的探討[J].中國(guó)西瓜甜瓜，2005（1）： 1-3.

[14] 伊鴻平，吳明珠，馮炯鑫，等. 中國(guó)新疆哈密瓜資源與品種改良研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（9）： 1779-1782.

[15] 湯謐.‘風(fēng)味甜瓜系列果實(shí)高糖高酸品質(zhì)形成的機(jī)理研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[16] 劉志文，傅廷棟，劉雪平，等. 作物分子標(biāo)記輔助選擇的研究進(jìn)展、影響因素及其發(fā)展策略[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22（增刊）：82-90.

[17] 苗麗麗，劉秀林，溫義昌. 關(guān)聯(lián)分析在QTL定位中的應(yīng)用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（2）： 12-14.

[18] 楊景華，王士偉，劉訓(xùn)言，等. 高等植物功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與利用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（11）： 3429-3436 .

[19] Andersen J R，Lübberstedt T. Functional markers in plants [J]. Trends in Plant Science，2003，8（11）： 554-560.

[20] Lübberstedt T，Zein I，Andersen J R，et al. Development and application of functional markers in maize[J]. Euphytica，2005，146（1）：101-108.

[21] Yael Danin-Poleg，TadmorY，Tzuri G，et al. Construction of a genetic map of melon with molecular markers and horticultural traits and localization of genes associated with ZYMV resistance [J]. Euphytica，2002，125（3）： 373-384.

[22] Harel -Beja R，Tzuri G，Portnoy V，et al. A genetic map of melon highly enriched with fruit quality QTLs and EST markers including sugar and carotenoid metabolism genes [J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121，（3）： 511-533.

[23] Obando-ulloa J M，Eduardo I，Monforte A J，et al. Identification of QTLs related to sugar and organic acid composition in melon using near-isogenic lines[J]. Scientia Horticulturae，2009，121（4）： 425-433.

[24] Sun X W，Liu D Y，Zhang X F，et al. SLAF-seq：an efficient method of large-scale De novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing [J]. Plos One，2013，8（3）1-9：（e58700）.

[25] Murray M，Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980，8（19）：668-673.

[26] Kent W J. BLAT-the BLAST-like alignment tool[J].Genome Research，2002，12（4）： 656-664.

[27] Takaqi H，Abe A，Yoshida K，et al. QTL-seq： rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations [J]. Plant Journal，2013，74（1）：174-183.

[28] Trick M，Maria-adamski N，Mugford S G，et al. Combining SNP discovery from next-generation sequencing data with bulked segregant analysis（BSA） to fine-map genes in polyploid wheat[J]. BMC Plant Biology，2012，12（14）： 14.