馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

（榆林學院 生命科學學院，陜西榆林719000）

脫除馬鈴薯病毒和紡錘塊莖類病毒（以下簡稱類病毒）主要采用莖尖組織培養(yǎng)法，并結合熱處理［1］、低溫療法［2］和病毒唑法［3］等提高脫毒效果。其中，熱處理結合莖尖組織培養(yǎng)法是一種應用較廣的馬鈴薯脫毒方法，在葡萄、草莓和蘋果等植物上也有報道。但是，由于不用植物或同一植物不同品種基因型和生理特性的差異，莖尖分化成苗的難易程度也不一樣。筆者以蓋瓊輝等［4］、Iqbal H 等［5］研究的馬鈴薯莖尖分化成苗培養(yǎng)基作為參考，在同一培養(yǎng)基上對‘克新1號’、‘夏波蒂’、‘費烏瑞它’、‘隴薯3號’、‘布爾班克’、‘青薯9號’、‘早大白’、‘冀張薯8號’等不同品種的莖尖培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，‘夏波蒂’馬鈴薯的莖尖分化成苗最難，成苗率僅為5%～10%，莖尖培養(yǎng)30d后仍以形成疏松的愈傷組織為主，成苗所需時間相對其他馬鈴薯品種也最長。近年來，王娟等［6］通過組織培養(yǎng)研究了不同莖尖大小、不同濃度和配比的細胞分裂素和生長素對脫毒效果的影響；于仙萍等［7］研究了采用不同處理方法對N88和D575馬鈴薯莖尖分化成苗率的影響；蔣瑜等［8］篩選了B13－6馬鈴薯莖尖脫毒的最佳培養(yǎng)基及影響因素；Aleksandar等［9］、Mutasim 等［10］分別研究了馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選及脫毒過程。但是，國內(nèi)外關于‘夏波蒂’馬鈴薯離體再生成苗的文獻報道較少［11－13］，未見‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗及病毒檢測的報道。本研究針對‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗率低，以熱處理結合莖尖剝離脫除病毒和類病毒為目標，篩選莖尖分化成苗最適宜的培養(yǎng)基，并通過RT－PCR 方法檢測再生苗病毒和類病毒的脫毒率，為脫毒苗擴繁和種薯繁育奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材 料

采集田間疑似帶毒馬鈴薯植株的塊莖，低溫休眠后，室溫暗處催芽，消毒后接種在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選成活苗擴繁，從而建立馬鈴薯無菌苗體系。用RT－PCR 方法檢測并篩選分別含有3 種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的2種材料，由本實驗室保存。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫上PVX、PVY、PLRV 的CP基因序列和PSTVd 全基因組序列，利用軟件Primer 5設計4對特異引物（表1）。

1．2 方 法

1．2．1 熱處理 取生長至高約1～2cm 的馬鈴薯無菌苗，在植物培養(yǎng)箱內(nèi)升溫1℃／d馴化20d左右，然后38℃／4h、22℃／12h光照培養(yǎng)，光照強度為3 000lx，18℃／8h暗培養(yǎng)，變溫熱處理4周以鈍化病毒。

表1 RT－PCR檢測所用引物Table 1 The primer pairs for detection

1．2．2 培養(yǎng)基組成 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，組成24種培養(yǎng)基（表2），蔗糖30g／L，卡拉膠5g／L，pH 5．8。培養(yǎng)基及不同植物生長調(diào)節(jié)劑所含藥品，均購自北京康貝斯生物科技有限公司。

表2 不同激素組合的培養(yǎng)基Table 2 The culture media with different hormone combinations

1．2．3 莖尖剝離與接種 剪取熱處理后長勢較好的無菌苗（部分擴繁無菌苗因耐熱差而長勢弱或死亡），以注射器針代替解剖針，在40倍體視顯微鏡下進行莖尖剝離。因剝離莖尖越大，成活率越高，但脫毒率低，為提高再生苗的脫毒率，試驗全部剝離帶1個葉原基的莖尖，莖尖大小約0．1～0．2 mm，壯苗莖尖稍大，弱細苗莖尖稍小。培養(yǎng)溫度為22℃，光照時間為16h／d，光照強度為3 000lx。

為降低污染率，每試管只接種1個莖尖，每處理培養(yǎng)基接種80個莖尖。10d后觀察并記錄莖尖生長情況，30d后統(tǒng)計莖尖愈傷組織誘導率和分化成苗率。

愈傷組織誘導率（%）＝形成愈傷組織數(shù)／接種莖尖個數(shù)×100%

分化成苗率（%）＝分化成苗數(shù)／接種莖尖個數(shù)×100%

1．2．4 RT－PCR 檢測 為檢測馬鈴薯莖尖剝離再生苗病毒和類病毒的脫除情況，隨機挑選熱處理前攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）且莖尖剝離分化后長勢良好的再生苗36株，同時挑選熱處理前攜帶類病毒（PSTVd）且莖尖剝離分化后長勢良好的再生苗24株，擴繁2 代后分別以RT－PCR 法進行病毒檢測。

Trizol法提取馬鈴薯再生苗葉片總RNA，反轉錄合成cDNA，PCR 分別擴增不同病毒和類病毒的目的基因片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。病毒檢測的Trizol試劑購自invitrigen 公司，cDNA 合成試劑盒、TaqDNA聚合 酶、dNTP、瓊脂糖等購自北京全式金生物科技有限公司。

PCR 反應體系包含模板DNA 3μL，正向（F）引物1μL，反向（R）引物1μL，10×PCR buffer 5 μL，2．5mmol／L dNTPs 4μL，TaqDNA 聚合酶1 μL，加ddH2O 至50μL。

PCR 反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30s，PVX、PSTVd 50℃（PVY、PLRV 59℃）退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

預期PVX、PVY、PLRV 的CP基因序列和PSTVd全基因組序列的擴增片段大小分別為620、400、336和251bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用滅菌TE（pH 8．0）稀釋至濃度為10 μmol／L。

2 結果與分析

2．1 6－BA 與NAA 及IAA 激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響

在細胞分裂素6－BA 和生長素NAA 的組合中（圖1），處理BN06的莖尖愈傷組織誘導率最低，為78．75%，分化成苗率最高，為11．25%；BN01 莖尖愈傷組織誘導率最高，達92．5%，但分化成苗率最低，僅6．25%。當NAA 和GA3濃度一定時，6－BA濃度（1．0～5．0 mg／L）與莖尖分化成苗成正相關，而與愈傷組織誘導成負相關；當6－BA 和NAA 濃度一定時，低濃度（0．2mg／L）、較高濃度（2．0mg／L）GA3能提高愈傷組織誘導率，而分化成苗率則降低。

在6－BA 與IAA 組合的培養(yǎng)基中（圖2），處理BI06莖尖愈傷組織誘導率最低，為71．25%，而分化成苗率最高，為15%；BI01莖尖愈傷組織誘導率最高，為80．0%，而分化成苗率則較低，僅7．5%。從圖1、2中發(fā)現(xiàn)，在NAA／IAA和GA3濃度一定時，6－BA 濃度（1．0～5．0mg／L）與莖尖分化成苗成正相關，而與愈傷組織的誘導成負相關；在6－BA 和GA3濃度一定時，IAA（0．5 mg／L）較NAA（0．2 mg／L）組合的培養(yǎng)基，莖尖的愈傷組織誘導率降低，分化成苗率則提高。

圖1 6－BA 與NAA 激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．1 The influence of potato meristem differentiation seedling by 6－BA and NAA hormone combinations

圖2 6－BA 與IAA 激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．2 The influence of potato meristem differentiation seedling by 6－BA and IAA hormone combinations

2．2 ZT與NAA 及IAA激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響

在ZT 與NAA 組合的培養(yǎng)基中（圖3），莖尖愈傷組織誘導率最高是ZN01處理，最低是ZN06，分別為77．5%和70．0%，二者差異不明顯；ZN04培養(yǎng)基的莖尖分化成苗率最高，為26．25%，ZN03分化成苗率最低，為12．5%。從圖3可以看出，當NAA和GA3濃度一定時，ZT 濃度（1．0～5．0 mg／L）與愈傷組織的誘導、莖尖分化成苗均成負相關，這與圖1、2中6－BA 濃度（1．0～5．0mg／L）的作用明顯不同。表明ZT 濃度太高會影響莖尖愈傷組織的誘導和莖尖分化成苗。在ZT 和NAA 濃度一定時，高濃度（2．0mg／L）、較低濃度（0．2 mg／L）GA3的作用明顯，能顯著提高莖尖分化成苗率。

圖3 ZT 與NAA 激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．3 The influence of potato meristem differentiation seedling by ZT and NAA hormone combinations

圖4 ZT 與IAA 激素組合對馬鈴薯莖尖分化成苗的影響Fig．4 The influence of potato meristem differentiation seedling by ZT and IAA hormone combinations

在ZT 與IAA 組合的培養(yǎng)基中（圖4），處 理ZI 03莖尖的愈傷組織誘導率和分化成苗率均最低，分別為61．25%、5%；處理ZI04的莖尖愈傷組織誘導率和分化成苗率均最高，分別為76．25%、23．75%。在IAA 和GA3濃度一定時，ZT 濃度（1．0～5．0mg／L）表現(xiàn)出與圖3中類似的作用，即與愈傷組織的誘導、莖尖分化成苗均成負相關。高濃度（2．0mg／L）GA3與前3種組合（圖1～3）的作用相同，均能促進莖尖分化成苗率，表明GA3（2．0 mg／L）是促進‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗較為合適的濃度。由圖3 和圖4 比較后發(fā)現(xiàn)，在ZT 和GA3的濃度一定時，雖然IAA（0．5mg／L）較NAA（0．2mg／L）能抑制愈傷組織的誘導，但并沒有提高莖尖分化成苗率，反而略有下降，表明ZT 與NAA組合比ZT 與IAA 組合的莖尖分化成苗效果好。

由圖1～3中6－BA 與ZT 對‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗率的比較后發(fā)現(xiàn)，ZT 較6－BA 對愈傷組織的誘導不利，但更有利于莖尖分化成苗。ZN04培養(yǎng)基的分化成苗率是26．25%（圖3），ZI04 培養(yǎng)基的分化成苗率是23．75%（圖4），而BN04培養(yǎng)基的分化成苗率是7．5%（圖1），BI04 培養(yǎng)基的分化成苗率是10%（圖2），6－BA 與ZT 的作用差異明顯。所以，在本試驗4類組合的24種培養(yǎng)基中，最適合‘夏波蒂’馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基是處理ZN04，即MS＋ZT1．0 mg／L＋NAA 0．2 mg／L＋GA32．0mg／L。

2．3 馬鈴薯莖尖分化成苗過程

在4類組合24種培養(yǎng)基中，從莖尖分化成苗過程來看，10d后即能誘導形成淺綠色、米粒大小的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織逐漸增大，30～40d達到穩(wěn)定狀態(tài)，以后逐漸開始分化芽和根，55～70d時可生長為完整的馬鈴薯再生苗，但不同培養(yǎng)基上生長的再生苗的生長勢不同，其中，ZN04（圖5，a）和ZI04（圖5，b）培養(yǎng)基上生長的再生苗葉色濃綠，根系發(fā)達，莖干生長健壯，二者均為正常組培苗；而BN03（圖5，c）培養(yǎng)基上生長的再生苗盡管葉色正常，但葉片腫脹下垂，形成根系也少，BI03再生苗（圖5，d）沒有形成根系，葉色失綠，愈傷組織偏大，二者均為弱化組培苗。與其他馬鈴薯品種相比，‘夏波蒂’馬鈴薯開始分化成苗和形成完整再生苗的時間均晚15～20d。

2．4 馬鈴薯再生苗病毒和類病毒的RT－PCR檢測

凝膠成像檢測發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT－PCR 電泳條帶差異明顯（圖6），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測結果，均擴增出不同病毒和類病毒的目的條帶；3、5、7泳道和9泳道沒有擴增出目的條帶，表明被檢測再生苗分別不含病毒PVX、PVY、PLRV 和類病毒PSTVd；部分再生苗的RTPCR 產(chǎn)物檢測出目的條帶，表明未脫除相應的病毒或類病毒。

圖5 不同激素組合培養(yǎng)基中的莖尖分化再生苗Fig．5 The differentiation seedling of potato by different hormone combinations

圖6 馬鈴薯病毒和類病毒的RT－PCR檢測Fig．6 The RT－PCR detection of potato virus and viroid

表3 再生苗病毒和類病毒的檢測結果Table 3 The detecting result of viruses and viroid of regenerated plantlets

再生苗3種病毒PVX、PVY 和PLRV 的檢測結果（表3）發(fā)現(xiàn)：36 株全部不攜帶PLRV，33株不攜帶PVY，25株不攜帶PVX。3株攜帶PVY 的再生苗同時攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y 病毒次之，卷葉病毒容易脫除，且3 種病毒PVX、PVY 和PLRV 的脫毒率分別為69．4%、91．7%和100%。

再生苗類病毒PSTVd的檢測結果（表3）發(fā)現(xiàn)：莖尖剝離脫毒后，24株再生苗中僅有2株脫除了類病毒，脫毒率僅為8．3%，表明熱處理結合莖尖剝離脫毒法也很難脫除PSTVd。對再生苗中未脫除PSTVd的22株再生苗進行二次莖尖剝離，成苗后經(jīng)過RT－PCR檢測，又有3株脫除了PSTVd，二次脫毒率升高為20．8%，表明通過二次莖尖剝離可以提高PSTVd的脫毒率。

3 討 論

熱處理結合莖尖組織培養(yǎng)法是國內(nèi)外普遍應用的馬鈴薯脫毒技術，能有效脫除危害馬鈴薯生長的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM 和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX 較難脫除，PLRV 容易脫除，本研究的試驗結果和國外一些學者［14－16］研究的結論是一致的。對于PVS、PVX 等較難脫除的病毒，主要采用是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結合莖尖組織培養(yǎng)法。而脫除PSTVd目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。本試驗以二次莖尖剝離法脫除類病毒，提高了類病毒的脫毒率。并在檢測無體細胞變異的情況下，嘗試以多次莖尖剝離法來提高類病毒的脫毒效果。在試驗中還發(fā)現(xiàn)，在脫除病毒或類病毒的過程中，提高無菌試管苗擴繁時的環(huán)境溫度到25～27℃，有利于提高試管苗的生長速度，快速剝?nèi)∩L旺盛的莖尖分生組織，能一定程度提高脫毒率。

莖尖組織培養(yǎng)法是剝離莖尖生長點的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒有直接關系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗為獲得脫毒效果更好的再生苗，以帶1個葉原基的莖尖為剝離對象，同時相對降低了莖尖分化成苗率，與國內(nèi)多數(shù)學者剝離帶1～2或2～3個葉原基的試驗區(qū)別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性的不同，需要不同的培養(yǎng)基環(huán)境。不同濃度激素的篩選及濃度配比尤為重要，按一定濃度激素配比來促進馬鈴薯莖尖分生組織愈傷組織的誘導和分化成苗。本試驗中的ZT 與6－BA 相比，能明顯提高‘夏波蒂’馬鈴薯的莖尖分化成苗率；高濃度的GA3也能提高莖尖分化成苗率。試驗同時發(fā)現(xiàn)，當ZT 的濃度為1．0mg／L，NAA 的濃度為0．2mg／L 與IAA 的濃度為0．5 mg／L 時，莖尖分化成苗率差異不大，所以，在ZT 和GA3濃度一定時，有待進一步試驗降低NAA 或者提高IAA 的濃度，可能會篩選出莖尖分化成苗率更高的培養(yǎng)基。

［1］MACDONALD D M．Heat treatment and meristem culture as a means of freeing potato varieties from viruses X and S［J］．PotatoResearch，1973，16（4）：263－269．

［2］WANG Q C，LIU Y，XIE Y．Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of potato leaf roll virus（PLRV）and potato virus Y（PVY）［J］．PotatoResearch，2006，49（2）：116－129．

［3］DANCI O，ERDE L，VIDACS LIVID．Influence of ribavirin on potato plants regeneration and virus eradication［J］．JournalofHorticulture，F(xiàn)orestryandBiotechnology，2009，12：421－425．

［4］GAI Q H（蓋瓊輝），WANG J CH（王季春）．Study on optimization of themedium for meristem tip differerntiating into potato［J］．Journal ofSouthwestAgriculturalUniversity（Nat．Sci．Edi．）（西南農(nóng)業(yè)大學學報·自然科學版），2005，27（3）：370－373（in Chinese）．

［5］IQBAL H，AISH M，ZUBEDA C．Morphogenic potential of three potato（Solanumtuberosum）cultivars from diverse explants，aprerequisite in genetic manipulation［J］．PakingJournalBotany，2005，37（4）：889－898．

［6］WANG J（王 娟），WANG ZH M（汪仲敏），WANG R Y（王瑞英），etal．Influencing factors of potato meristem culture for virus elimination［J］．ChinaPotato（中國馬鈴薯），2010，24（3）：172－175（in Chinese）．

［7］YU X P（于仙萍），CHEN W（陳 煒），JIN L P（金黎 平），etal．Influence of various treatments on plantlet regeneration percentage of shoot tip culture［J］．ChinaPotato（中國馬鈴薯），2010，24（4）：196－198（in Chinese）．

［8］JIANG Y（蔣 瑜），ZHANG L F（張麗芳），ZHU W X（朱維賢），etal．Analysis of selection and influencing factors of medium culture in potato stem apex detoxication［J］．JournalofChangjiangVegetable（長江蔬菜），2010，（4）：11－13（in Chinese）．

［9］ALEKSANDAR C，BRANKA V，DRAGAN V，etal．Agrobacterium－mediated transformation of two Serbian potato cultivars［J］．African JournalofBiotechnology，2010，9（30）：4 644－4 650．

［10］MUTASIM M K，KHADIGA G A，RASHEID S M．Callus formation and organogenesis of potato（SolanumtuberosumL．）cultivar Almera［J］．JournalofPhytology，2010，2（5）：40－46．

［11］LI J（李 娟），CHENG ZH H（程智慧），ZHANG G Y（張國裕）．Establishment of efficient regeneration system from leaf explants of potato［J］．ActaBot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物學報），2004，24（4）：610－614（in Chinese）．

［12］LI J（李 娟），CHENG ZH H（程智慧），ZHANG G Y（張國裕）．Study on vitro regeneration technology from stem explants of four potato cultivars［J］．JournalofNorthwestSci－TechUniv．ofAgri．a(chǎn)ndFor．（Nat．Sci．Edi．）（西北農(nóng)林科技大學學報·自然科學版），2006，34（3）：122－126（in Chinese）．

［13］GUSTAFSON V，MALLUBHOTLA S，MACDONNELL J．Transformation and plant regeneration from leaf explants ofSolanumtuberosumL．cv．‘Shepody’［J］．PlantCell，TissueandOrganCulture，2006，（85）：361－366．

［14］BIPASHA CHAKRAVARTY，GEFU WANG－PRUSKI．Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influenceingAgrobacterium－mediated transformation［J］．AdvancesinBioscienceandBiotechnology，2010，（1）：409－416．

［15］HALTERMAN D，CHARKOWSKI A，VERCHOT J．Potato，viruses，and seed certification in the USA to provide healthy propagated tubers［J］．PestTechnology，2012，（S1）：1－14．

［16］MAMIDALA P，SWAMY NANNA R．Efficientinvitroplant regeneration，flowering and fruiting of drawf tomato cv．Micro－Msk［J］．PlantOmicsJournal，2009，2（3）：98－102．