皮子鳳門麗慧張 靜周園宋鳳瑞劉志強(qiáng)*

1(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所國家質(zhì)譜中心(長春)吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130022)2(吉林大學(xué)藥學(xué)院,長春 130021)

研究報(bào)告

五味子治療大鼠糖尿病腎病作用機(jī)制的血清代謝組學(xué)研究

皮子鳳1門麗慧2張 靜2周園2宋鳳瑞1劉志強(qiáng)*1

1(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所國家質(zhì)譜中心(長春)吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130022)2(吉林大學(xué)藥學(xué)院,長春 130021)

采用基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法,通過分析大鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化,研究五味子治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)并腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。給藥12周后,采用試劑盒方法測定尿蛋白、尿肌酐的含量,結(jié)果表明五味子水提取物可以顯著降低模型動(dòng)物的尿蛋白含量(p＜0.05),對糖尿病大鼠腎病并發(fā)癥具有一定的改善作用。采用UPLC/Q-TOF-MS方法分析了五味子對糖尿病腎病大鼠的血清代謝輪廓,分析了健康組、模型組和五味子給藥組的大鼠血清,采用偏最小二乘法-判別分析(Partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。PLS-DA得分圖顯示健康組、模型組和五味子組的代謝輪廓有顯著差別,根據(jù)正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)載荷圖篩選,將對各組分離貢獻(xiàn)大的化合物的串聯(lián)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù),經(jīng)Human Metabolome Database(HMDB)等數(shù)據(jù)庫檢索,進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配,鑒定出黃尿酸、油酰胺、棕櫚酰胺、尿酸、5-羥基己酸、硫酸對甲酚、對甲酚葡萄糖苷酸7種內(nèi)源性代謝物為生物標(biāo)記物。研究結(jié)果表明五味子通過影響色氨酸代謝、嘌呤代謝、腸內(nèi)菌代謝、脂肪酸代謝等通路對糖尿病腎病發(fā)揮治療作用,其中嘌呤代謝、腸內(nèi)菌代謝通路可能是五味子發(fā)揮治療作用的重要途徑。

五味子;糖尿病腎病;血清;代謝組學(xué)

1 引 言

北五味子為木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果實(shí),具有斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神等功效[1]。研究表明,五味子有效成分主要包括木脂素、多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸、脂肪油、氨基酸、色素、鞣質(zhì)等,藥理作用涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及泌尿系統(tǒng)等各個(gè)方面。

研究表明,五味子油可以改善STZ聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗,改善β細(xì)胞的功能缺陷,提高胰島素的分泌量,增加胰島素和胰十二指腸同源盒因子基因的表達(dá),從而發(fā)揮降血糖作用[2]。五味子多糖可控制糖尿病小鼠體重減輕、多飲和血糖升高的癥狀[3],能顯著促進(jìn)肝糖原的合成,抑制肝糖原分解而發(fā)揮降糖作用,且對糖尿病所引起的脂代謝異常也具有改善作用。五味子抗炎、抗氧化、清除氧自由基、增加周圍組織對葡萄糖的攝取等藥理活性在糖尿病腎病治療中效果明顯[4,5]。五味子醇提液能顯著改善C57BL/614小鼠的糖尿病腎病,阻抑腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及纖溶酶原活化抑制因子-1表達(dá)是其作用機(jī)制[6]。

目前,文獻(xiàn)報(bào)道的五味子治療糖尿病作用機(jī)制的研究,大多數(shù)是從藥理作用以及分子角度進(jìn)行的。近年來,越來越多的研究采用代謝組學(xué)方法考察中藥治療糖尿病機(jī)制[7～9],但尚無從五味子整體作用角度對其治療糖尿病腎病的作用機(jī)制進(jìn)行研究的報(bào)道。本研究采用代謝組學(xué)方法,基于UPLC/ Q-TOF-MS技術(shù),對五味子治療前后糖尿病腎病大鼠血清中內(nèi)源性代謝物進(jìn)行了分析鑒定,從中藥作用的整體性角度,初步闡明了五味子治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

WatersAcquity UPLC液相色譜系統(tǒng)、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀和Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)。

五味子購自北京同仁堂藥店;鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司);乙腈和甲酸(色譜純,美國Fisher公司);水經(jīng)Millipore制得。SD大鼠購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證:SCXK (吉)2013-0001。尿蛋白試劑盒、尿肌酐試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號20140515, 20140506)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

正常對照組(Control group):給予8只SD雄性大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料,正常喂養(yǎng)。

Ⅱ型糖尿病大鼠造模參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

16只糖尿病大鼠隨機(jī)分為兩組:模型組(Model group)和五味子組(WWZ group)。五味子組每日灌胃五味子水提液,劑量為每kg體重5 g生藥,模型組和空白組灌胃蒸餾水。連續(xù)給藥12星期后,收集24 h尿液,按照試劑盒方法測定尿蛋白、尿肌酐含量。末次給藥24 h后,動(dòng)物斷頭處死,取血, 3000 r/min離心,收集空白對照組、模型組和五味子組的血清,-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品收集和制備

五味子水提物制備:藥材粉碎后稱取適量,加10倍體積水浸泡20 min,加熱回流提取兩次,每次45 min,合并提取液,濃縮后凍干,陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

樣品檢測前,4℃融化血清樣品,在100 μL血清樣品中加入400 μL無水乙腈,劇烈振蕩30 s,室溫靜置10 min,樣品在4℃條件下,12000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm濾膜過濾,濾液供UPLC/MS測定。

2.4 色譜質(zhì)譜條件及樣品分析

色譜條件:A超純水(0.1%甲酸),B乙腈;梯度洗脫:0～2 min,5%～60%B;2～4 min,60%～70%B;4～7 min,70%～100%B;7～8 min:100%B。柱溫:30℃;流速:0.5 mL/min,進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件:電離源溫度120℃;錐孔氣為氮?dú)?流速50 L/h;去溶劑氣為氮?dú)?溫度350℃,流速700 L/h。正離子模式下毛細(xì)管電壓為3.0 kV,錐孔電壓為30 V,提取錐孔電壓為5.0 V;負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為2.0 kV,錐孔電壓為30 V,提取錐孔電壓為5.0 V。甲酸鈉建立質(zhì)量軸標(biāo)準(zhǔn)曲線,亮氨酸腦啡肽進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正。串聯(lián)質(zhì)譜碰撞氣為氬氣,低碰撞能為5 eV,高碰撞能為25～35 eV。

為保證整個(gè)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性,在本實(shí)驗(yàn)中使用質(zhì)控樣品(Quality control,QC)進(jìn)行方法驗(yàn)證,QC樣品由每個(gè)正常樣品各取100μL混合而得。為避免誤差樣品的檢測順序?yàn)殡S機(jī)進(jìn)行。對樣品進(jìn)行分析前,先運(yùn)行5次QC樣品,以起到平衡系統(tǒng)的作用。樣品的檢測過程中,每檢測5個(gè)正常樣品后運(yùn)行1次QC樣品以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

樣本用UPLC/Q-TOF-MS進(jìn)行檢測,得到樣品的總離子流色譜圖,利用MarkerLynx對采集得到的譜圖進(jìn)行離子對的提取、峰對齊、峰匹配和峰強(qiáng)度校正等操作,將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物的保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息的csv格式文件。再將其導(dǎo)入EZinfo 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。使用HMDB(http://www. hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)等生物學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物標(biāo)志物的鑒定和代謝通路的分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 五味子對糖尿病腎病大鼠尿肌酐、尿蛋白含量的影響

糖尿病腎病早期,腎小球基底膜受損,過濾能力下降,會出現(xiàn)尿蛋白增加、尿肌酐含量減少的狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1),大鼠經(jīng)糖尿病造模后12周,尿液中蛋白數(shù)量顯著增加(p＜0.05)、尿肌酐水平顯著下降(p＜0.01),說明糖尿病模型大鼠發(fā)生了腎病并發(fā)癥,腎小球?yàn)V過能力下降。經(jīng)五味子治療后,尿蛋白排泄水平明顯低于模型組(p＜0.05),尿肌酐水平顯著增加(p＜0.05),表明五味子對糖尿病腎病具有一定的治療作用。

表1 五味子對糖尿病腎病大鼠尿肌酐、尿蛋白含量的影響Table 1 Effect of Schisandra chinensis(WWZ)on the contents of creatinine and protein in urine of rat diabetic nephropathy

3.2 五味子治療糖尿病腎病的血清代謝組學(xué)研究

3.2.1 血清代謝輪廓分析采用UPLC/Q-TOF-MS進(jìn)行樣本的分離和數(shù)據(jù)采集,圖1為正、負(fù)離子模式下各組典型的總離子流基峰強(qiáng)度色譜圖(Base peak intensity chromatogram,BPI)。從圖1可見,空白對照組、模型組和五味子治療組大鼠血清代謝物具有明顯的差異。

圖1 空白組(A)、模型組(B)和五味子組(C)大鼠血清在正離子模式(1)和負(fù)離子模式(2)下的基峰強(qiáng)度色譜圖(BPI)Fig.1 Typical serumal base peak intensity chromatograms in positive(1)and negative(2)ion mode of different group(control group(A),model group(B)and WWZ group(C))

由空白對照組、模型組和五味子組的偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)得分圖(圖2)可以看出,在正譜或負(fù)譜中,3組均能明顯分開,其中正離子模式下模型的評價(jià)指標(biāo)為 R2X=0.9986, Q2=0.8675,負(fù)離子模式下模型的評價(jià)指標(biāo)為R2X=0.9943,Q2=0.9026。如圖2所示,STZ造模成功12周后,模型大鼠血清中的內(nèi)源性代謝物與正常動(dòng)物相比發(fā)生了明顯的變化,經(jīng)五味子治療后,糖尿病大鼠血清代謝輪廓向著正常組方向轉(zhuǎn)變。

3.2.2 潛在標(biāo)記物鑒定對五味子治療組和糖尿病組在STZ造模12周的血樣進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。正離子模式下模型評價(jià)指標(biāo)為R2Y=0.9986、Q2=0.8675,負(fù)離子模式下模型評價(jià)指標(biāo)為R2Y=0.9942和Q2=0.9026,說明模式質(zhì)量良好。如OPLS-DA得分圖(圖3 A和C)所示,五味子治療組和糖尿病模型組可以明顯區(qū)分。載荷圖上遠(yuǎn)離原點(diǎn)的化合物為潛在的標(biāo)記物(圖3B和3D),同時(shí)將VIP＞1且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量(p＜0.05)作為標(biāo)記物的判斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)它們精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果以及與Human Metabolome Database(HMDB)和Mass Bank.jp等代謝產(chǎn)物和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配,對可能的潛在標(biāo)記物進(jìn)行初步鑒定,再用標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證,鑒定了7種化合物,結(jié)果列于表2。

圖2 健康對照組(-)、模型組(◆)和五味子治療組(▲)在糖尿病造模12周的大鼠血清正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下的PLS-DA得分圖Fig.2 Partial least squares-discriminant analysis(PLS-DA)score plots of serum metabolic profiling of control group (-),model group(◆),WWZ group(▲)in positive mode(A),and negative mode(B)after diabetes induced for 12 weeks

圖3 五味子治療組(-)和模型組(▲)糖尿病造模12周的大鼠血清在正離子模式(A)和負(fù)離子模式(C)下的OPLS-DA得分圖和正離子模式(B)和負(fù)離子模式(D)下PLS-DA的載荷圖Fig.3 Orthoganal partial least squares(OPLS)-DA score plots of serum metabolic profiling of WWZ group(-)and model group(▲)in positive mode(A)and negative mode(C)and OPLS-DA loading plots in positive mode(B)and negative mode(D)after diabetes induced for 12 weeks.

正離子模式下以保留時(shí)間為0.690 min,m/z 206.0452的離子為例,根據(jù)精確分子量、計(jì)算分子的不飽和度、結(jié)合同位素峰相對強(qiáng)度進(jìn)行篩選,推斷其化學(xué)式是C10H8NO4。該離子在串聯(lián)質(zhì)譜中產(chǎn)生m/z 160.0382和132.0370的碎片,經(jīng)計(jì)算確認(rèn)碎片離子為[M-HCOOH+H]+和[M-HCOOH-CO+H]+,經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索確認(rèn)為黃尿酸(Xanthurenic acid),其串聯(lián)質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律見圖4a。

德克薩斯大學(xué)阿林頓分校生物系教授Woo-Suk Chang分析認(rèn)為：“作物產(chǎn)量不僅取決于土壤的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)狀況，還取決于土壤中的微生物組成和活性，特別是根際土壤?！比欢?，近幾十年來，隨著人類活動(dòng)而導(dǎo)致的環(huán)境污染和生態(tài)破壞的問題日益突出，土壤侵蝕、鹽堿化、酸化、沙漠化、重金屬污染等導(dǎo)致的土壤退化或污染現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，土壤健康狀況趨于惡化。目前，我國耕地土壤40%以上面積出現(xiàn)退化。

負(fù)離子模式下以保留時(shí)間0.343 min,m/z 167.2000的離子為例,根據(jù)精確分子量推測可能的化學(xué)式是C5H4N4O3。碎片離子包括m/z 124.0158和96.0617(圖4b),經(jīng)分析確認(rèn)碎片離子分別為[M-CHNO-H]-和[M-C2HNO2-H]-,經(jīng)數(shù)據(jù)庫和結(jié)構(gòu)推斷確認(rèn)為尿酸(Uric acid)。

3.3 標(biāo)記物代謝通路分析

黃尿酸(Xanthurenic acid)是色氨酸經(jīng)犬尿氨酸代謝通路產(chǎn)生的代謝物。據(jù)Kotake等報(bào)道,糖尿病患者體內(nèi)色氨酸代謝紊亂,羥基犬尿素和黃尿酸代謝增加[10]。Murakami報(bào)道黃尿酸可與胰島素連接形成復(fù)合體[11],復(fù)合體的降血糖活性和吸收葡萄糖作用較游離胰島素低,降低了胰島素的生物學(xué)效應(yīng),從而導(dǎo)致糖尿病。五味子給藥后血液中黃尿酸含量降低,對糖尿病模型的色氨酸代謝途徑有積極的調(diào)節(jié)作用。

表2 五味子治療糖尿病大鼠的潛在生物標(biāo)記物Table 2 Potential biomarkers in diabetes rats treated by Schisandra chinensis

圖4 黃尿酸(a)和尿酸(b)二級串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectra of xanthurenic acid(a)and uric acid(b)

油酰胺(Oleamide)是長鏈脂肪酰胺,研究發(fā)現(xiàn)具有降低身體核心體溫等多種生理功能。油酰胺沒有特定的受體,但最有可能作用大麻素受體(CB-1和CB-2)[12]和幾種血清素受體[13],而這兩種大麻素和血清素受體參與控制胰島素分泌。有研究證明CB-1受體可以促進(jìn)人骨骼肌細(xì)胞和小鼠脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗[14]。棕櫚酰胺(Palmitic amide),屬于脂肪酰胺,由棕櫚酸降解產(chǎn)生。五味子治療后,油酰胺、棕櫚酰胺水平下調(diào),說明五味子對糖尿病大鼠脂肪酸代謝通路具有調(diào)節(jié)作用。

尿酸(Uric acid)是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,能夠減緩腎血流量,激活腎素血管緊張素系統(tǒng)。高血尿酸也可加速腎臟損傷,造成腎小管不可逆性損傷[15],會造成低密度脂蛋白膽固醇的氧化和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。研究表明,尿酸是糖尿病腎病的一種介質(zhì),可通過增強(qiáng)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性和炎癥級聯(lián)反應(yīng)等途徑介導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生[16],加重糖尿病患者的腎臟損傷程度。五味子治療后血尿酸水平下調(diào),可減少模型動(dòng)物血清中高尿酸水平對腎臟的損傷,從而發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用。

5-羥基己酸(5-Hydroxyhexanoic acid)是一種脂肪酸的單羥基羧酸降解產(chǎn)物。在伴有酮酸中毒的糖尿病患者中檢測到該化合物[18]。五味子的治療減少了糖尿病腎病大鼠血清中5-羥基己酸的濃度,表明五味子在減輕糖尿病酮酸中毒癥狀中可能達(dá)到重要的作用。

4 結(jié) 論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合PLS-DA的分析手段,進(jìn)行了五味子治療糖尿病腎病大鼠血清代謝組學(xué)研究。共鑒定了7種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,分別為黃尿酸、油酰胺、棕櫚酰胺、尿素、5-羥基己酸、硫酸對甲酚和對甲酚葡萄糖苷酸,說明五味子通過影響色氨酸代謝、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、腸內(nèi)菌代謝等通路發(fā)揮治療作用,其中嘌呤代謝、腸內(nèi)菌代謝通路是其減少腎病損傷的重要作用途徑。從五味子整體作用角度初步闡明了其治療糖尿病腎病的作用機(jī)理。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81373952)

《分析化驗(yàn)工技術(shù)問答》

王秀萍 主編 王博、馬春香 副主編

本書針對分析化驗(yàn)工應(yīng)知應(yīng)會的分析知識與技能,以問答的形式介紹了化學(xué)分析基礎(chǔ)知識、化學(xué)分析操作技能知識、酸堿滴定法、氧化還原滴定法、配位滴定法、沉淀滴定法、稱量分析法等化學(xué)分析知識與操作,電化學(xué)分析、紫外-可見分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法和原子吸收光譜法等儀器分析方法。另外,結(jié)合當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室的管理需求,書中融入了分析過程質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)室管理的內(nèi)容。

書 號:9787122210586 定價(jià):39.0元

出版時(shí)間:2014年10月 開本:16 化學(xué)工業(yè)出版社出版

Serumal Metabonomic Study on Mechanism of Schisandra Chinensis in Rat Diabetic Nephropathy

PI Zi-Feng1,MEN Li-Hui2,ZHANG Jing2,ZHOU Yuan2, SONG Feng-Rui1,LIU Zhi-Qiang*1

1(National Center for Mass Spectrometry in Changchun,Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Chemistry and Mass Spectrometry Jilin Province,Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,
Changchun 130022,China)
2(School of Pharmaceutical Science,Jilin University,Changchun 130021,China)

A serumal metabonomics method based on UPLC/Q-TOF-MS was established to investigate the mechanism of Schisandra chinensis to treating diabetic nephropathy.The diabetic model was established by feeding with high-fat and high-sucrose chow and streptozotocin intraperitoneal injection.After intragastric administration for 12 weeks,the content of protein and creatinine in rat urine was detected.The results showed that Schisandra chinensis could reduce the content of protein in urine of diabetic rat(p＜0.05)and ameliorate the condition of diabetic nephropathy.The serum metabolic profiling was analysed by using UPLC/ Q-TOF-MS and partial least squares-discriminated analysis(PLS-DA)was used for data analysis.The score of PLS-DA showed that there was significant difference among the metabolic profile of control group,model group and Schisandra chinensis group(WWZ).Potential biomarkers of Schisandra chinensis ameliorating diabetic nephropathy were selected by orthogonal partial least squares(OPLS)-DA model.According to the results of OPLS-DA,the MS/MS data of each compound which provided greater contribution to separation of each group were searched from the HMDB databases.Seven endogenous metabolites were identified as potential biomarkers such as xanthurenic acid,palmitic amide,oleamide,uric acid,5-hydroxyhexanoic acid,p-cresol sulfate,and p-cresol glucuronide.The results revealed that Schisandra chinensis mainly affected the pathways of tryptophan metabolism,gut microbiota metabolism,purine metabolism and fatty acid metabolism to treating type 2 diabetes mellitus.The gut microbiota metabolism and purine metabolism was an important pathway on diabetic nephropathy.

Schisandra chinensis;Diabetic nephropathy;Serum;Metabonomics

2 July 2014;accepted 28 August 2014)

2014-07-02收稿;2014-08-28接受

本文系國家自然科學(xué)基金(No.81373952)資助

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10.11895/j.issn.0253-3820.140564