李曉婷

摘 要：目的：通過體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，給予抗proBDNF血清，觀察其對體外海馬神經(jīng)元發(fā)育及存活的影響。方法：取新生0～1h的SD大鼠海馬組織，體外培養(yǎng)神經(jīng)元，給予抗proBDNF羊血清處理進行形態(tài)學觀察，通過細胞免疫組織化學方法觀察。結(jié)果：體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長有明顯的階段性。給予抗proBDNF處理后，其表達量與神經(jīng)元生長狀態(tài)、存活細胞數(shù)成正比。培養(yǎng)1d組的表達水平高于3d、7d組，差值具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：給予外源性抗proBDNF羊血清處理后，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長狀態(tài)良好且突起數(shù)目增多，提示內(nèi)源性的proBDNF抑制神經(jīng)元的發(fā)育，促進凋亡，給予外源性抗體后，減弱其生物學作用，神經(jīng)元發(fā)育抑制因素減弱，存活細胞數(shù)、突起數(shù)增多。

關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元 proBDNF p75NTR sortilin

中圖分類號：R651 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）05（b）-0241-02

神經(jīng)元的發(fā)育對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成及信號的傳導等神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行非常關(guān)鍵。在神經(jīng)元發(fā)育過程中，細胞的生存、生長、遷移、與其他細胞建立功能性聯(lián)系，以及神經(jīng)再生過程中軸突的生長等，除了受內(nèi)源性程序的調(diào)控，還受到局部環(huán)境因素的影響。例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。

BDNF是一類多肽，通過促進神經(jīng)細胞的增殖、分化及存活而影響海馬的神經(jīng)發(fā)生，與活動依賴性突觸可塑性有關(guān)，在學習與記憶過程中發(fā)揮重要作用[1]。外源性BDNF還可以促進體外培養(yǎng)的新生鼠海馬顆粒細胞（DGCs）的存活及分化。與體內(nèi)其他蛋白質(zhì)的合成和分泌一樣，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子由分子量為30-35kDa的前體物質(zhì)--腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體（precursor of brain derived neurotrophic factor， proBDNF）蛋白水解而來。傳統(tǒng)的觀點認為這些神經(jīng)營養(yǎng)因子前體是無活性的，但2001年，Lee等首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子前體可以促進細胞凋亡[1]。此后進一步的研究表明，proBDNF可能有著與BDNF相反的功能，Teng等發(fā)現(xiàn)proBDNF能夠促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡。

1 方法

1.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

取新生0-1h的SD大鼠，在細胞培養(yǎng)間取出兩大腦半球，制成細胞懸液，靜置后取上層懸液，進行計數(shù)后按照實驗要求以1×105/mL密度接種于包被好的培養(yǎng)板或玻片上。37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后根據(jù)細胞的生長情況及實驗要求，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況。

1.2 分組

將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機分為抗proBDNF羊血清處理組、羊血清對照組及正常未處理組。各組選取1d、3d、7d三個時間點進行觀察（給予干預組以加干預為0d計算）。

1.3 神經(jīng)元鑒定

選取3d的細胞進行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)。根據(jù)公式計算出神經(jīng)元純度：[NeuN陽性細胞數(shù)/著色細胞數(shù)（總細胞數(shù)）]×100%=神經(jīng)元陽性率（即神經(jīng)元純度）。

1.4 數(shù)據(jù)收集

根據(jù)實驗要求選取不同時間點、不同條件的細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察。用于免疫組化的細胞顯色后于鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（x±S）表示。組內(nèi)比較用t檢驗，組間比較用單因素方差分析。凡P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的生長情況

普通倒置光學顯微鏡下觀察，接種0h，大多數(shù)細胞呈圓球型懸浮于培養(yǎng)基中，折光性較好，單個散在分布。接種12～24h貼壁后，神經(jīng)元周圍長出類似于偽足的包裹體，邊界不整齊；培養(yǎng)3d，包裹體周圍開始有一些向外生長的突起，其中一個突起較其它突起迅速生長延伸，發(fā)育成較長的軸突，其余幾個短小的突起則形成樹突，神經(jīng)元之間逐漸形成網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)7d，軸突繼續(xù)延伸，樹突分支增多，神經(jīng)元軸突和樹突相互交叉、連接，形成復雜的網(wǎng)絡(luò)。

2.2 處理組海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育情況

體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，當1d組給予抗proBDNF與DMEM/F12以1：20比例稀釋濃度處理時，所選取的處理組培養(yǎng)1d、3d、7d的細胞生長狀態(tài)、存活細胞數(shù)明顯多于陰性對照及正常對照組，且多突起神經(jīng)元明顯增多；濃度過高或過低都不利于神經(jīng)元的生長。同時，當神經(jīng)元形態(tài)穩(wěn)定后也就是7d時給予抗proBDNF血清處理，無突起神經(jīng)元出現(xiàn)空泡樣變化。生長3d的神經(jīng)元給予抗proBDNF處理后，細胞形態(tài)變化不明顯，生長狀態(tài)影響不大，組間差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

3.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元的體外原代培養(yǎng)

新生鼠與胎鼠相比，神經(jīng)元分化程度高，神經(jīng)突起發(fā)育成熟，神經(jīng)元之間以及與纖維組織之間的連接比較緊密。而且有研究表明，通過透射電鏡觀察出生1d的新生大鼠海馬，偶見神經(jīng)元突觸，且結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全、突觸連接部位很短、突觸小泡極少。因此為提高神經(jīng)元的純度以及存活率，我們參照原有的比較權(quán)威的培養(yǎng)方法，取出新生0～1h的SD大鼠海馬組織，在解剖顯微鏡下剔除腦膜，精確定位取材，以保證組織的純度。經(jīng)機械吹打10～20次，使組織分散成單細胞懸液。以1×105/mL密度種植于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，24h后全量換液。培養(yǎng)3d后，經(jīng)NeuN鑒定，神經(jīng)元的純度可以達到90%以上。

3.2 proBDNF對海馬神經(jīng)元發(fā)育的影響

眾多研究發(fā)現(xiàn)，在猴、大鼠的大部分腦區(qū)，如大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核、基底核、小腦、丘腦、孤束核、下丘腦、中腦、腦橋、延髓和脊髓有proBDNF表達。在胞內(nèi)，proBDNF經(jīng)一些酶修飾轉(zhuǎn)變?yōu)锽DNF，然后以BDNF的形式分泌到胞外。

同時有動物實驗表明，出生后的幾周內(nèi)proBDNF表達水平逐漸上升，且在幼年小鼠體內(nèi)proBDNF的總量要大于BDNF。小鼠海馬區(qū)proBDNF水平呈動態(tài)變化，在軸突投射和突觸形成過程中表達水平最高[3]。這一結(jié)果提示proBDNF在神經(jīng)元發(fā)育早期有可能高表達。proBDNF作為抑制因子在脊髓損傷后神經(jīng)再生過程中發(fā)揮作用。對于突觸可塑性影響的研究則提示proBDNF與BDNF對突觸可塑性具有雙向調(diào)節(jié)作用。

在該實驗中發(fā)現(xiàn)，在摸索給予抗proBDNF血清濃度時，相同時間點、相同接種濃度，給予不同濃度抗proBDNF血清時神經(jīng)元生長狀態(tài)表現(xiàn)各不相同，既可以表現(xiàn)為促進生長，也可以表現(xiàn)為抑制生長。從中我們選取了神經(jīng)元形態(tài)變化最為明顯的一組做實驗分析。根據(jù)神經(jīng)元素生長的五個階段，培養(yǎng)7d時，軸突繼續(xù)延伸，樹突分支增多，神經(jīng)元軸突和樹突相互交叉、連接，形成復雜的網(wǎng)絡(luò)。給予抗proBDNF血清處理后，7d時神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的較為密集，且突起分支較多。繼續(xù)培養(yǎng)到14d、20d時，正常對照組出現(xiàn)懸浮細胞，干預組中出現(xiàn)空泡樣細胞。7d后縮短換液間隔，空泡樣改變未見改善。其原因未明確，因此該論文中統(tǒng)計分析結(jié)果所選取的時間點最長為7d。

因為該實驗所給予的是外源性的干預，無法排除內(nèi)源性proBDNF的影響，所以對于proBDNF對神經(jīng)元發(fā)育的影響及作用機制，本實驗結(jié)果無法給予明確的解答。

4 結(jié)語

給予外源性抗proBDNF羊血清處理后，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長狀態(tài)良好且突起數(shù)目增多，提示內(nèi)源性proBDNF抑制神經(jīng)元的發(fā)育，促進凋亡，給予外源性抗體后，減弱其生物學作用，神經(jīng)元發(fā)育抑制因素減弱，存活細胞數(shù)、突起數(shù)增多。

在神經(jīng)元生長發(fā)育的晚期，因其發(fā)育已成熟，細胞處于凋亡期，內(nèi)源性proBDNF表達增多，當給予相同濃度抗proBDNF羊血清處理時，無法中和內(nèi)源性proBDNF的促凋亡作用，所以在培養(yǎng)7d的神經(jīng)元基礎(chǔ)上給予抗proBDNF羊血清干預后，表現(xiàn)出空泡樣變化。

參考文獻

[1] Junming Tan，Jiangang Shi， Gguodong Shi，et al.Changes in compressed neurons from dogs with acute and severe cauda equina constrictions following intrathecal injection of brain-derived neurotrophic factor-conjugated polymer nanoparticles[J].Neural regeneration research，2013（3）：233-243.

[2] 王圓圓，張文斌，陳靜，等.大鼠海馬神經(jīng)元neurobasal無血清的原代培養(yǎng)方法[J]. 2008（6）：547-551.

[3] Yang J，Siao CJ，Nagappan G，et al. Neuronal release of proBDNF[J].Nat Neurosci，2009（2）：113-115.