劉達(dá)綜，高慧珊，劉 娜，何潔明，徐樹蘭，鄭常格，呂思行

(廣州市生物防治站 廣東廣州510460)

基礎(chǔ)研究

一株球孢白僵菌的形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定

劉達(dá)綜，高慧珊，劉 娜，何潔明，徐樹蘭，鄭常格，呂思行*

(廣州市生物防治站 廣東廣州510460)

利用PDA培養(yǎng)基，對(duì)收集自廣東茂名的玉米螟(Pyrausta nubilalis)病原真菌(編號(hào)：Bba1菌株)進(jìn)行分離培養(yǎng)。對(duì)Bba1菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)、大小進(jìn)行觀察和測量，從形態(tài)學(xué)初步鑒定該菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；同時(shí)對(duì)Bba1菌株的26s rDNA和rDNA ITS區(qū)域進(jìn)行序列分析，與NCBI數(shù)據(jù)庫中球孢白僵菌的同源性達(dá)到99%以上。最終判定來自玉米螟的病原真菌Bba1菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

白僵菌 分離 鑒定

球孢白僵菌是國內(nèi)外廣泛用于害蟲生物防治的殺蟲真菌之一，被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的一種昆蟲病原真菌，能侵染15個(gè)目149個(gè)科的700多種昆蟲和10多種蟬螨。[1]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在分類上屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，叢梗孢目(Moniliales)，叢梗孢科(Moniliaceae)，白僵菌屬(Beauveria)。白僵菌屬的典型特征為產(chǎn)孢細(xì)胞(瓶梗狀)常濃密簇生，有時(shí)輪生或單生，或直接生在氣生菌絲、稍有分化的分生孢子?；蚺虼蟮呐菽疑?，球形或瓶狀，下部膨大，反復(fù)向頂部軸式產(chǎn)孢，形成膝狀彎曲且具有小齒突的產(chǎn)孢軸。產(chǎn)孢細(xì)胞和泡囊常增生，在分生孢子梗及菌絲上聚集成卵狀或球狀的孢子頭。分生孢子透明，壁薄。[2]傳統(tǒng)分類學(xué)主要是根據(jù)菌株分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)判斷菌種，往往受到主觀作用的影響。真菌rDNA具有保守區(qū)域，在菌種分類上具有重要意義。利用rDNA的特性進(jìn)行分子生物學(xué)研究，為菌株種屬判定提供更為客觀的依據(jù)。

本研究在Bba1菌株形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，對(duì)菌株26s rDNA和rDNA ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，以期使菌種鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確、科學(xué)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

Bba1為廣州市生物防治站采自廣東茂名的玉米螟病原真菌。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)參照文獻(xiàn)[3-4]的方法配制。

1.3 方法

1.3.1 Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生長情況的觀察

按照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法觀察記錄菌落形態(tài)特征。每天定時(shí)用游標(biāo)卡尺量出菌落長寬并記錄，分析菌株生長情況，記錄7d。定期在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.3.2 Bba1菌株分生孢子的形態(tài)大小測定

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至15d時(shí)，在無菌條件下，刮取平板上生長的白僵菌菌落，轉(zhuǎn)移到三角燒瓶中，加入一定量的0.5%吐溫-80無菌水和滅菌玻璃珠，在漩渦振蕩器上充分振蕩使孢子均勻分散，制備成孢子懸浮液。并在顯微鏡下用軟件測定分生孢子的直徑。

1.3.3 Bba1菌株的分子生物學(xué)鑒定

在無菌條件下，分別把菌株用接種針接種于液體培養(yǎng)基中，放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d(培養(yǎng)溫度為26℃，濕度為95%)。將液體培養(yǎng)好的菌絲體經(jīng)濾紙過濾，自然晾干。用材料盒收集置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。方法參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行菌株總DNA的抽提。根據(jù)真菌26s rDNA和 rDNA的ITS區(qū)設(shè)計(jì)出特異性引物(見表1)對(duì)菌株進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系30μL：ddH2O為12μL；2XMaster Mix為15μL；Primer 1(10μM)為1μL；Primer 2(10μM)為1μL；Template為1μL。引物ITS5/ITS4的反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5min；接著35個(gè)循環(huán)：94℃變性45s，56℃退火溫度40s，72℃延伸40s；72℃后延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in the study

對(duì)Bba1菌株26s rDNA和 rDNA的ITS序列進(jìn)行克隆、測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用Clustsl X和MEGA 5軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bba1菌株菌落形態(tài)特征

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)情況如圖1所示，菌落色澤為乳白色。菌落質(zhì)地為粉狀，菌落薄、中間褶皺、呈放射狀生長。菌落底部無色或淡黃色。在光學(xué)顯微鏡下Bba1菌株產(chǎn)孢細(xì)胞輪生或單生，分生孢子梗反復(fù)向頂部軸式產(chǎn)孢，結(jié)果形成膝狀彎曲的具有小齒突的產(chǎn)孢軸。分生孢子梗光滑呈穗狀，分生孢子透明，壁薄且為球形，大小為2.1μm×2.7μm，表面光滑，與球孢白僵菌特點(diǎn)相似。

圖1 Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Bba1 strain on PDA culture medium

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基平板上的生長量如表2所示。Bba1菌株菌落生長特點(diǎn)是從第2d到第4d出現(xiàn)一個(gè)高峰，從第5d開始放慢了生長速度，到第7d菌落未覆蓋滿培養(yǎng)基。

表2 Bba1菌株菌落生長量Tab.2 Comparison of colony growth of the Bba1 strain

2.2 Bba1菌株的分子生物學(xué)鑒定

提取Bba1菌株基因組DNA為模板，利用引物SF-1/SF-4和ITSs1/ITSs4對(duì)26s rDNA和rDNA ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到 630bp和247bp片段。對(duì)Bba1菌株DNA模板的PCR檢測結(jié)果如圖2所示。

測序結(jié)果分析顯示Bba1菌株26s rDNA擴(kuò)增長度為558bp(GenBank基因登錄號(hào)為FJ755242.1)，Bba1 菌株rDNA ITS區(qū)序列擴(kuò)增長度為247bp(GenBank基因登錄號(hào)為HQ722920.1)。將測序得到的兩條序列片段提交到GenBank中分別與已知序列進(jìn)行對(duì)比，用Clustsl X和MEGA 5軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3、4看出，該菌株都與球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在一個(gè)分支上，其同源性均為99%。通過序列分析，最終確定該菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

圖2兩組引物對(duì)Bba1菌株DNA模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2Bba1 strain PCR amplification results influnced by two sets of primers

圖3 Bba1菌株26s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on 26s rDNA sequences

圖4 Bba1菌株rDNA ITS區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on rDNA ITS sequences

3 討 論

球孢白僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌，也是一類重要的環(huán)保型生物防治菌。關(guān)于球孢白僵菌的分類一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，單純依靠形態(tài)特征對(duì)球孢白僵菌進(jìn)行分類，很難將與其相近的菌株區(qū)分開。因此在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)技術(shù)可以客觀準(zhǔn)確地判定菌株種屬。本研究利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對(duì)Bba1菌株菌落形態(tài)、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)、大小進(jìn)行測定，同時(shí)結(jié)合分子生物學(xué)方法，分別對(duì)rDNA保守區(qū)域 26s rDNA和 rDNA ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，通過測序分析，建立起系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步證明傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Bba1菌株為球孢白僵菌。Bba1菌株的鑒定為下一步開展球孢白僵菌防治玉米螟制劑的研究及生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 李正躍，張文青. 球孢白僵菌對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的毒力及其與常用農(nóng)藥的生物相容性測定[J]. 植物保護(hù)，2005，3(31)：57-61.

［2］ 李增智. 白僵菌的分類和鑒定[J]. 中國蟲生真菌研究與應(yīng)用，1990(2)：89-95.

［3］ 王更生. 中藥材白僵蠶主要生產(chǎn)條件的優(yōu)化及其指紋圖譜的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［4］ 劉丹，吳淑賢，韓福生，等. 白僵菌對(duì)沙棘木蠹蛾幼蟲的致病力及其生物學(xué)特性研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，2(23)：93-96.

［5］ 劉吉平，呂思行，米紅霞. 生物防治白僵菌與家蠶病原白僵菌的生物學(xué)特性初步比較[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(3)：442-448.

［6］ 呂思行，劉吉平，湯歷，等. 兩廣地區(qū)家蠶白僵菌的SSRs遺傳多樣性[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2012，55(10)：1142-1148.

Morphological and Molecular Identification of a Beauveria bassiana Strain

LIU Dazong，GAO Huishan，LIU Na，HE Jieming，XU Shulan，ZHENG Changge，LV Sixing*
(Guangzhou Biological Control Station，Guangzhou 510460，Guangdong Province，China)

A strain(No．Bba1)was isolated using PDA culture medium from the muscardine cadaver of Pyrausta nubilalis collected from Maoming in Guangdong Province．In this study，the colony morphology，spore structure，spore shape and size of Bba1 strain were observed and measured，and it was initially identified as Beauveria bassiana．At the same time，its 26s rDNA and rDNA ITS were sequenced and then compared with those of Beauveria bassiana in NCBI database．The results showed the homology was above 99%．Eventually，Bba1 strain was identified as Beauveria bassiana.

Beauveria bassiana；isolation；identification

S884.3

：A

：1006-8945(2015)08-0019-03

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廣東省重點(diǎn)科研基地建設(shè)項(xiàng)目(2012A061300001)；廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目(2013B060500004)；廣州市科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(201509020002)。

2015-07-10