柳 莉，李秀璋，郭長輝，李春杰

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

不同培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌Epichloё生長與產(chǎn)孢的影響

柳 莉，李秀璋，郭長輝，李春杰

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

本研究以分離自西藏早熟禾(Poatibetica)、甘肅臭草(Melicaprzewalskvi)和麥賓草(Elymustangutorum)的6個(gè)內(nèi)生真菌菌株(分別為西藏早熟禾內(nèi)生真菌Ep-003和Ep-004,甘肅臭草內(nèi)生真菌Em-014和Em-016,麥賓草內(nèi)生真菌Ee-001和Ee-003)為研究對(duì)象，分別在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥稈煎液瓊脂(WSA)、玉米粉瓊脂(CMA)和水瓊脂(WA)4種培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，觀測(cè)菌落生長速率、菌落形態(tài)特征、產(chǎn)孢量和孢子特性。結(jié)果表明，同一菌株在不同培養(yǎng)基上的生長速率一般為PDA和CMA上的最大，WSA和WA上最小；不同菌株在同一培養(yǎng)基上，西藏早熟禾的Ep-003菌株生長最快，在PDA上直徑最大,為46.42 mm，麥賓草內(nèi)生真菌次之，甘肅臭草的Em-014菌株生長最慢，在WA上直徑最小,為7.07 mm；在4種培養(yǎng)基上，菌株的產(chǎn)孢量有顯著差異(P<0.05)，分別為Ep-003只在WA上產(chǎn)孢，其他5種菌株在WA和WSA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較多，在PDA和CMA上產(chǎn)孢較少； Em-016和Ep-004在4種培養(yǎng)基上的孢子長度無顯著差異(P>0.05)，Em-014在WSA上的孢子長最小,為3.77 μm，其他菌株無顯著差異(P>0.05)，Ee-003在PDA上孢子長最長,為8.43 μm，在其他3種培養(yǎng)基上無顯著差異(P>0.05)；Ep-004、Em-016和Ee-003在4種培養(yǎng)基上孢子梗長度均無顯著差異(P>0.05)，Em-014在WA上孢子梗最長,為16.74 μm，在WSA上最短,為14.09 μm，Ee-001在CMA上孢子梗最長,為18.59 μm，在WSA上最短,為13.40 μm。

共生真菌；分生孢子；生長速度；產(chǎn)孢特征

禾草內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是在宿主體內(nèi)度過全部或大部分的生命周期, 而宿主植物不顯示任何外部癥狀的一類真菌[1]。這個(gè)類群的內(nèi)生真菌一般是指Epichloё屬的真菌及其無性階段Neotyphodium屬，根據(jù)最新國際真菌命名法規(guī)，現(xiàn)統(tǒng)一稱為Epichloё內(nèi)生真菌[2]。有關(guān)Epichloё屬及其無性階段內(nèi)生真菌生理學(xué)與生物學(xué)特性的報(bào)道相對(duì)較少。有關(guān)對(duì)Epichloё內(nèi)生真菌生長條件及其產(chǎn)孢特性影響的研究主要集中在培養(yǎng)基種類[3]、培養(yǎng)溫度[4]、糖分含量及最優(yōu)碳源[5-6]等。培養(yǎng)基的種類對(duì)Epichloё屬3種內(nèi)生真菌的生長速度及其菌落形態(tài)影響顯著[3]。Neotyphodium屬的5種內(nèi)生真菌生長所需最適糖分含量差異顯著[5]。此外，White等[6]對(duì)產(chǎn)生和不產(chǎn)生子座的E.typhinum在3種不同糖濃度培養(yǎng)基中的菌落生長情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)糖分含量對(duì)其生長影響顯著，并篩選出了最適碳源培養(yǎng)基。溫度不僅對(duì)內(nèi)生真菌菌落生長速度及菌落形態(tài)造成影響[3]，同時(shí)對(duì)內(nèi)生真菌的產(chǎn)孢特性影響顯著[4]。國內(nèi)關(guān)于內(nèi)生真菌產(chǎn)孢機(jī)制的研究主要集中在甘肅內(nèi)生真菌(E.gansuense)[7]及分離自高羊茅(Festucaarundinacea)[7]、黑麥草(Loliumperenne)[8]和中華羊茅(Festucasinensis)[9]的內(nèi)生真菌。而對(duì)于分離甘肅臭草(Melicaprzeualskyi)、西藏早熟禾(Poatibetica)和麥賓草(Elymustangutorum)的內(nèi)生真菌的生物學(xué)與生理學(xué)的研究甚少。

甘肅臭草是廣泛分布于甘肅、青海等地的一種多年生根莖類草本植物，家畜往往因其產(chǎn)生的怪異味道而拒絕采食，是我國西北天然草地上比較常見的一種雜草植被物種[10]。研究發(fā)現(xiàn)，遭受甘肅臭草入侵的草地會(huì)在短期內(nèi)演變?yōu)橐云錇閮?yōu)勢(shì)種的退化草地，這種毒雜草的大量滋生、擴(kuò)展及蔓延，嚴(yán)重影響著家畜及其他野生草食動(dòng)物對(duì)草地的有效利用[11]。目前，有關(guān)甘肅臭草內(nèi)生真菌的研究?jī)H見于Li等[12]對(duì)其分離培養(yǎng)的簡(jiǎn)要描述，但對(duì)于其在不同培養(yǎng)基上的生物學(xué)及其產(chǎn)孢特征尚未進(jìn)行研究報(bào)道。

西藏早熟禾是一種禾本科早熟禾屬的多年生草本植物，分布在海拔2 500～3 200 m的亞高山草甸[13]，抗寒，耐濕冷，生活力極強(qiáng)，在高寒草地分布廣，參與度小，數(shù)量少，但草質(zhì)柔嫩，葉量豐富，適口性好，是牛、馬、羊常均喜食的優(yōu)良牧草。有關(guān)西藏早熟禾內(nèi)生真菌的研究主要集中在帶菌率[14]、簡(jiǎn)要體外培養(yǎng)特征[12]等，但是相對(duì)較為深入的生物學(xué)特征尚未見報(bào)道。

麥賓草系禾本科披堿草屬多年生草本植物，稈單生或呈疏叢型，須根較粗，高100～120 cm，直徑可達(dá)5.5 mm，具4～5節(jié)，基部節(jié)稍曲[15]。麥賓草在我國主要分布于青海、西藏、甘肅、內(nèi)蒙古等大部地區(qū)，國外在尼泊爾等地也有分布。有關(guān)麥賓草內(nèi)生真菌的研究主要集中在其帶菌率[14]，對(duì)于其產(chǎn)孢機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。

Epichloё屬內(nèi)生真菌在體外培養(yǎng)中生長極為緩慢，且在常規(guī)培養(yǎng)基上一般不易產(chǎn)孢，而孢子是禾草內(nèi)生真菌生物學(xué)研究的一個(gè)重要組成部分。本研究分析不同類型培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌產(chǎn)孢特性的影響，旨在為尋找內(nèi)生真菌的體外培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基提供理論依據(jù)，同時(shí)為內(nèi)生真菌分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 內(nèi)生真菌 內(nèi)生真菌菌株分離自西藏早熟禾、甘肅臭草和麥賓草3種宿主植物，由蘭州大學(xué)草地保護(hù)研究所保存。6個(gè)菌株分別根據(jù)其宿主禾草的屬名縮寫，依此分別命名為西藏早熟禾內(nèi)生真菌Ep-003、Ep-004，甘肅臭草內(nèi)生真菌Em-014、Em-016和麥賓草內(nèi)生真菌Ee-001、Ee-003。分別轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，22 ℃黑暗培養(yǎng)箱(GXZ-380C，浙江)中生長4周，待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 參照Li等[16]的方法，制作馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、麥稈煎液瓊脂培養(yǎng)基(WSA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。PDA制作方法：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂粉17 g，加蒸餾水至1 000 g。CMA制作方法：玉米粉300 g，瓊脂粉17 g，加蒸餾水至1 000 g。WA制作方法：瓊脂粉20 g，加蒸餾水至1 000 g。WSA制作方法：麥稈20 g，瓊脂粉17 g，加蒸餾水至1 000 g，其中，麥稈先加入1 000 g蒸餾水，放入溫度為120 ℃的高溫滅菌鍋(HG-50，日本)中進(jìn)行煮沸滅菌20 min，再用雙層紗布過濾至加入瓊脂粉的三角瓶中，再進(jìn)行一次高溫滅菌，最后將所有滅過菌的培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿約倒25 mL，制成平板培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基上的菌落生長 參照Li等[16]的方法，將生長于22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的內(nèi)生真菌用直徑為4 mm的打孔器純培養(yǎng)菌落打成菌餅，隨后將菌餅分別轉(zhuǎn)接到PDA、WA、WSA和CMA平板培養(yǎng)基中央，每皿1個(gè)菌餅。第4周用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(溯源測(cè)量?jī)x器有限公司，湖南)測(cè)定菌落直徑，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 產(chǎn)孢量的測(cè)定 4周試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行產(chǎn)孢量的測(cè)定，將無菌水加入到生長好的內(nèi)生真菌培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)輕輕攪動(dòng)，使孢子充分落下，滴一滴菌懸液至載玻片上，40×10倍光鏡條件下觀察每個(gè)視野中的孢子數(shù)，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，共觀察10個(gè)視野，求平均值。

1.2.3 孢子、孢子梗的測(cè)定 培養(yǎng)4周以后，用接種針挑取菌絲少許放入滴有一滴無菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕按壓，然后在矯正過的40×顯微鏡(每小格2.44 μm)下測(cè)定孢子的長、寬，孢子梗的長、寬，記錄格數(shù)，計(jì)算大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel錄入，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析，Ducan法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌菌落特征的影響

同一菌株在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)存在差異，菌落正面的特征為：Ep-003在PDA上菌落正面稀疏(圖1)，在CMA、WSA上較稀疏(圖1-3、圖1-5)，在WA上氣生菌絲最稀薄(圖1-7)；在PDA和WSA上菌落背面為白色至褐色(圖1-2，圖1-6)，而在CMA和WA上菌落背面均為白色(圖1-4，圖1-8)。Ep-004在PDA上正面為白色，致密，棉狀，在其他3種培養(yǎng)基上正面為白色，中央突起，氣生菌絲稀薄(圖2)，其中在WA上氣生菌絲最稀薄(圖2-8)。背面的特征為：在PDA為白色至褐色，在WSA上為深褐色，在CMA和WA上為白色。Em-014在PDA、WSA和WA上菌落正面為白色，致密，在CMA上氣生菌絲稀??；菌落背面特征與Ep-004在4種培養(yǎng)基上的一致。Em-016的菌落特征與Em-014的相同(圖3、圖4)。Ee-001和Ee-003在PDA上菌落正面稍稀疏，在WSA上菌落正面致密(圖5)，棉狀，氣生菌絲稀薄(圖5-3、圖5-6)，在CMA和WA上菌落正面稀疏，氣生菌絲稀薄(表1)。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌菌落生長的影響

培養(yǎng)4周后，6個(gè)菌株中除Ep-004和Ee-001外，其余菌株在PDA和CMA上的菌落直徑顯著大于在WSA和WA上的菌落直徑(P<0.05)(表2)。

對(duì)于西藏早熟禾、甘肅臭草、麥賓草3種內(nèi)生真菌而言，甘肅臭草的內(nèi)生真菌菌落直徑最??；西藏早熟禾的Ep-003菌株直徑最大。對(duì)于同一種菌的不同菌株而言，菌落直徑也存在差異，如Ep-003在WSA上的菌落直徑顯著大于Ep-004的(P<0.05)，Em-014和Em-016在CMA和WSA上菌落直徑差異不顯著(P>0.05)(表2)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌產(chǎn)孢特性的影響

除Ep-003只在WA產(chǎn)孢外，其他5個(gè)菌株在4種培養(yǎng)基上均產(chǎn)孢(表3)。麥賓草內(nèi)生真菌在4種培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，甘肅臭草內(nèi)生真菌次之，西藏早熟禾內(nèi)生真菌的產(chǎn)孢量是3個(gè)菌里最少的；Ep-004在4種培養(yǎng)基上都產(chǎn)孢，且在CMA和WSA上產(chǎn)孢較多；甘肅臭草內(nèi)生真菌在WSA上產(chǎn)孢較多；麥賓草內(nèi)生真菌在CMA、WSA和WA上產(chǎn)孢較多，其中Ee-001在WA上產(chǎn)孢最多。

對(duì)4種培養(yǎng)基上的6個(gè)菌株而言，產(chǎn)孢量大小順序?yàn)閃SA>WA>CMA>PDA，原因很可能是WSA和WA營養(yǎng)貧乏，適合生殖生長。

在PDA上，菌株Ee-003的孢子最長，其他菌株孢子長度不存在顯著差異(P>0.05)；CMA上，Ep-004的孢子最長；WSA上，Em-014的孢子最短(表4)。同一菌株在不同培養(yǎng)基上的孢子長度也存在差異，Ep-004在WA上孢子最短；Em-014、Em-016和Ee-001都在WSA上孢子最短；Ee-003在PDA上的孢子最長(表4)。

各菌株的孢子寬在不同培養(yǎng)基上存在一定的差異，其中Ee-003的孢子最寬(表5)。 對(duì)不同菌的內(nèi)生真菌而言，孢子寬度大小為麥賓草>西藏早熟禾>甘肅臭草；對(duì)不同菌株而言，甘肅臭草內(nèi)生真菌的兩個(gè)菌株在WSA上的寬度均小于在其他3種培養(yǎng)基上的孢子寬；Ee-001在CMA上的孢子寬小于在其他3種培養(yǎng)基上的孢子寬(表5)。

圖3 22℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的內(nèi)生真菌Em?014在PDA、CMA、WSA和WA上的菌落特征Fig．3 FeaturesofEpichloёEm?014onmediaPDA，CMA，WSAandWAafter4weeksgrowthat22℃anddarkcondition圖4 22℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的內(nèi)生真菌Em?016在PDA、CMA、WSA和WA上的菌落特征Fig．4 FeaturesofEpichloёEm?016onculturemediaPDA，CMA，WSAandWAafter4weeksgrowthat22℃anddarkcondition

同一培養(yǎng)基上不同菌株的孢子寬度存在差異。PDA上，菌株Ee-003孢子最寬；CMA上，菌株Ee-001孢子寬度最??；WSA上，菌株Ep-004和菌株Ee-003孢子寬度無顯著差異(P>0.05)且顯著大于其他3個(gè)菌株(P<0.05);WA上，菌株Ep-003的孢子寬度最大(表5)。

同一菌株在不同培養(yǎng)基上的孢子形狀存在差異(表6)，PDA上，Ep-004的孢子形狀為橢圓形，Em-014的為近圓形，Em-016的為彎月形，Ee-001和Ee-003的孢子均為腎形；CMA上，Ep-004、Ee-001、Ee-003(圖7)、Em-016的孢子均為近圓形，Em-014的為腎形。WSA上，Ep-004的孢子形狀為橢圓形，Em-014(圖1)和Ee-003為腎形，Ee-001和Em-016為近圓形；WA上，Ep-003孢子為腎形(圖7)，Ep-004為近圓形，Em-014和Em-016為橢圓形，Ee-001和Ee-003為腎形。

同一培養(yǎng)基上不同菌株孢子的大小也存在差異，PDA上，Ee-003的孢子最大，其他各菌株間無顯著差異(P>0.05)；Ep-004在CMA和WSA上孢子最大，WA上，Ep-003的孢子最大(表6)。

不同培養(yǎng)基上，各菌株的孢子大小趨勢(shì)大致表現(xiàn)為：在PDA培養(yǎng)基上的孢子均較大，甘肅臭草內(nèi)生真菌的菌株在WSA上的孢子小于在其他3種培養(yǎng)基上的孢子大小。

圖5 22℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的內(nèi)生真菌Ee?001在PDA、CMA、WSA和WA上的菌落特征Fig．5 FeaturesofEpichloёEe?001onculturemediaPDA，CMA，WSAandWAafter4weeksgrowthat22℃anddarkcondition圖6 22℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的內(nèi)生真菌Ee?003在PDA、CMA、WSA和WA上的菌落特征Fig．6 FeaturesofEpichloёEe?003onculturemediaPDA，CMA，WSAandWAafter4weeksgrowthat22℃anddarkcondition

對(duì)不同菌系的內(nèi)生真菌的孢子梗長度而言，麥賓草>西藏早熟禾>甘肅臭草；對(duì)不同菌株而言，菌株Ep-004、Em-016和Ee-003在4種培養(yǎng)基上孢子梗的長度均不存在顯著差異(P>0.05)，Em-014在WSA上孢子梗最短，Ee-001在CMA上孢子梗最長，在WSA上最短(表7)。

就不同培養(yǎng)基來看，在PDA和WA上，5個(gè)菌株的孢子梗長度均無顯著差異(P>0.05);CMA上，麥賓草內(nèi)生真菌的菌株孢子梗長度無顯著差異且最長，而在WSA上，這兩個(gè)菌株的孢子梗長度存在顯著差異(P<0.05)(表7)。

對(duì)不同菌系的內(nèi)生真菌而言，孢子?；繉挼拇笮辂溬e草菌系>甘肅臭草菌系>西藏早熟禾菌系；對(duì)不同菌株而言，除Ep-003外，其他5個(gè)菌株在PDA上的孢子?；繉挿謩e大于其他3種培養(yǎng)基上的孢子梗基部寬(表8)。

從同一培養(yǎng)基上的不同菌株來看，在PDA上，除Em-014外，其他3個(gè)菌株的孢子?；繉挾葻o顯著差異(P>0.05)；CMA上，Ee-001孢子?；繉挾茸畲螅籛SA上，Ep-004的孢子?；繉捵钚?；WA上Em-016的孢子?；繉捙c其他5個(gè)菌株存在顯著差異(P<0.05)且最大，Ep-003、Em-014、Ee-001、Ee-003菌株的孢子梗基部寬度無顯著差異(表8)。

表2 不同培養(yǎng)基中西藏早熟禾、甘肅臭草和麥賓草內(nèi)生真菌在22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4周的菌落直徑

Table 2 Colony diameter of Epichloё spp isolated from Poa tibetica, Melica przewalskyi and Elymus tangutorumafter 4 weeks growth at 22 ℃ on different culture media mm

注：同行不同大寫字母表示同一菌株不同培養(yǎng)基間差異顯著(P<0.05)，同列不同小寫字母表示同一培養(yǎng)基不同菌株間差異顯著(P<0.05)。表4、5、6、7、8同。

Note: Different capital letters within the same row mean significant difference among culture media at 0.05 level, and different lower case letters within the same column mean significant difference among 6 strains at 0.05 level. The same in Table 4, Table 5, Table 6, Table 7 and Table 8.

表3 不同培養(yǎng)基中西藏早熟禾、甘肅臭草和麥賓草內(nèi)生真菌的菌株在22 ℃黑暗條件下4周后的產(chǎn)孢特性

注：-表示無數(shù)據(jù)居。

Note: -，no spore.

表4 不同培養(yǎng)基上22 ℃黑暗條件下生長4周的6個(gè)菌株孢子長度

表5 不同培養(yǎng)基上22 ℃黑暗條件下生長4周的6個(gè)菌株孢子寬度

圖7 22 ℃黑暗條件下生長4周的內(nèi)生真菌菌株的孢子及孢子梗Fig.7 Spores and sporophores of Epichloё after 4 weeks growth under 22 ℃ and dark condition 表6 不同培養(yǎng)基上22 ℃黑暗條件下生長4周的菌株的孢子大小及形狀 Table 6 Size and shape of spores of 6 strains after 4 weeks growth under 22 ℃ and dark conditions on different culture media

菌株StrainPDA孢子大小Sporesize/μm形狀Shape CMA孢子大小Sporesize/μm形狀Shape Ep?003 - - - -Ep?00417．49±0．19bA橢圓形Oblong15．12±0．09aB近圓形NearroundEm?01412．20±0．22bA近圓形Nearround11．57±0．05bA腎形ReniformEm?01612．42±0．06bA彎月形Falcate12．38±0．06bA近圓形NearroundEe?00112．47±0．05bA腎形Reniform7．31±0．19cC近圓形NearroundEe?00341．26±1．00aA腎形Reniform12．43±0．11bB近圓形Nearround菌株StrainWSA孢子大小Sporesize/μm形狀Shape WA孢子大小Sporesize/μm形狀Shape Ep?003 - -20．28±0．14a腎形ReniformEp?00413．94±0．14aB橢圓形Oblong11．18±0．11cdC橢圓形OblongEm?0146．89±0．11dB腎形Reniform9．92±0．07dA橢圓形OblongEm?0169．28±0．12cB近圓形Nearround13．32±0．08bA腎形ReniformEe?0019．45±0．04cB近圓形Nearround12．75±0．07bcA腎形ReniformEe?00311．61±0．12bB腎形Reniform11．91±0．06bcB腎形Reniform

3 討論

不同培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌的生長有一定的作用，研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草內(nèi)生真菌在燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基(OMA)上的生長優(yōu)于PDA和CMA，原因是OMA培養(yǎng)基營養(yǎng)較為豐富，利于內(nèi)生真菌菌落的生長[16]。本研究中6個(gè)菌株均在CMA及PDA培養(yǎng)基中生長優(yōu)于WSA和WA培養(yǎng)基，原因是前兩種培養(yǎng)基的營養(yǎng)較后者豐富。

表7 不同培養(yǎng)基上22 ℃黑暗條件下生長4周的6個(gè)菌株孢子梗長度

表8 不同培養(yǎng)基上22 ℃黑暗條件下生長4周的6個(gè)菌株孢子?；繉?/p>

不同培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征產(chǎn)生了一定的影響，如Ep-003在PDA培養(yǎng)基上菌落背面為乳黃色，中間褐色，而在其他3種培養(yǎng)基上均為白色；Ep-004在PDA培養(yǎng)基上菌落正面致密，絮狀，而在WSA培養(yǎng)基上疏松。同一培養(yǎng)基上，不同菌株之間也存在差別，WA培養(yǎng)基上，Ep-003和Ep-004菌落表面疏松，而Em-014、Em-016、Ee-001和Ee-003菌落表面均致密。PDA培養(yǎng)基上48株中華羊茅(Festucasinensis)內(nèi)生真菌菌株的形態(tài)特征及生長特性表現(xiàn)出較高的多樣性[17]，這與本研究中6個(gè)菌株在4種培養(yǎng)基上的形態(tài)特性同樣表現(xiàn)出了多樣性較為類似，說明內(nèi)生真菌菌株在相同條件下表現(xiàn)出較多的外部特征，這很可能也是因?yàn)榕c其具有的較為多樣的外在表現(xiàn)有關(guān)。

高羊茅(F.arundinacea)內(nèi)生真菌在WA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，在CMA和SNA兩種培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較多，而在DMA和OMA上均產(chǎn)孢[16]，原因是產(chǎn)孢屬于生殖生長，而菌落生長屬于營養(yǎng)生長，WA培養(yǎng)基營養(yǎng)貧乏，適合產(chǎn)孢，PDA培養(yǎng)基營養(yǎng)較好，不利于產(chǎn)孢。本研究中，在PDA和CMA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較少，而在WA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較多。

分離自西藏早熟禾的菌株Ep-003只在WA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，而Ep-004在4種培養(yǎng)基上都產(chǎn)孢，原因可能是同一菌系的不同菌株之間存在遺傳多樣性，但是需要更進(jìn)一步的研究。

WSA培養(yǎng)基以前只用于病原菌的促產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)，但李彥忠[18]發(fā)現(xiàn)WSA適于埃里磚格孢病原真菌的生長與產(chǎn)孢。本研究首次采用WSA培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌的產(chǎn)孢特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，大多數(shù)菌株在WSA上產(chǎn)孢量大于WA，其原因可能是WSA中含有禾本科植物的某些特定成分，這種物質(zhì)有利于促進(jìn)內(nèi)生真菌的產(chǎn)孢。

由于Epichloё屬內(nèi)生真菌的數(shù)量較多，所以有關(guān)不同種內(nèi)生真菌在其生理特征和形態(tài)特征上存在多樣性[19-20]。同時(shí)，Sun等[21]對(duì)剪股穎(Agrostismatsumurae)內(nèi)生真菌在PDA上的產(chǎn)孢特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株在同一培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的孢子大小各不相同。本研究中各菌株的分生孢子大小，從孢子長、孢子寬、孢子梗長到孢子梗寬，在不同培養(yǎng)基上也存在多態(tài)性，這說明菌株的表型特征除了受到培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分影響外，還取決定于其自身的遺傳組成[22]。

[1] Siegel M R,Latch G C M,Johnson M C.Fungal endophyte of grasses[J].Annual Review of Phytopathology,1987,25:293-315.

[2] Leuchtmann A,Bacon C W,Schardl C L,White J F,Tadych M.Nomenclatural realignment ofNeotyphodiumspecies with genusEpichloё[J].Mycologia,2014,106(2):202-215.

[3] Latch G C M,Christensen M J,Samuels G J.Five endophytes ofLoliumandFestucain New Zealand[J].Mycotaxon,1984,20:535-550.

[4] White J F,Morgan-Jones G.Endophyte-host associations in forage grasses.X.cultural studies on some species ofAcremoniumsect.albo-lanosa,including a new species,A.starrii[J].Mycotaxon,1987,30:87-95.

[5] Morgan-Jones G,White J F,Piontelli E L.Endophyte-host associations in forage grasses.XIII.Acremoniumchilense,an undescribed endophyte occurring inDactylisglomeratain Chile[J].Mycotaxon,1990,39:441-454.

[6] White J F,Morrow A C,Morgan-Jones G,Chambless D A.Endophyte-host associations in forage grasses.Primary stromata formation and seed transmission inEpichloёtyphina:Developmental and regulatory aspects[J].Mycologia,1991,83(1):72-81.

[7] 李春杰.醉馬草-內(nèi)生真菌共生體生物學(xué)與生態(tài)學(xué)特性的研究[D].蘭州:蘭州大學(xué)博士論文,2005.

[8] 王靜,任安芝,謝鳳行,魏宇昆,高玉葆.幾種誘導(dǎo)黑麥草內(nèi)生真菌產(chǎn)孢的方法[J].菌物學(xué)報(bào),2005,24(4):590-596.

[9] 金文進(jìn),李春杰,南志標(biāo).中華羊茅內(nèi)生真菌Neotyphodiumsp.生物學(xué)與生理學(xué)特性的研究[J].菌物學(xué)報(bào),2009,28(3):363-369.

[10] 趙成章,龍瑞軍.石羊河上游甘肅臭草型退化草地植被恢復(fù)過程[J].山地學(xué)報(bào),2008,26(3):286-292.

[11] 徐松鶴,尚占環(huán),龍瑞軍,齊文娟.黑土灘退化草地、高寒濕地及其交錯(cuò)區(qū)植物群落結(jié)構(gòu)多樣性[J].草原與草坪,2007(4):45-49.

[12] Li X Z,Li C J,Nan Z B.Detection and isolation of endophytes fromMelicaprzewalskyiandPoatibetica[A].Proceedings of the 8th International Symposium on Fungal Endophyte of Grasses[C].Lanzhou,China:Lanzhou University,2012:42-45.

[13] 李陽春,張宏利.祁連山東段至蘭州一線早熟禾屬植物的初步研究[J].國外畜牧學(xué)——草原與牧草,1997(2):24.

[14] 南志標(biāo),李春杰.禾草-內(nèi)生真菌共生體在草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的作用[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2004,24(3):605-616.

[15] 劉尚武.青海植物志(第4卷)[M].西寧:青海人民出版社,1999:97-103．

[16] Li C J,Nan Z B,Li F.Biological and physiological characteristics ofNeotyphodiumgansuensesymbiotic withAchnatheruminebrians[J].Microbiological Research,2008,163(4):431- 440.

[17] 楊洋,陳娜,李春杰.甘肅中華羊茅內(nèi)生真菌形態(tài)多樣性[J].草業(yè)科學(xué),2011,28(2):278-283.

[18] 李彥忠.沙打旺黃矮根腐病(Embellisiaastragalisp.nov.Li&Nan)的研究[D].蘭州:蘭州大學(xué)博士論文,2007.

[19] Christensen M J,Latch G C M,Tapper B A.Variation within isolates ofAcremoniumendophytesfrom perennial ryegrasses[J].Mycological Research,1991,95(8):918-923.

[20] Christensen M J,Latch G M Variation among isolates ofAcremoniumendophytes(A.coenophialumand possiblyA.typhinum) from tall fescue (Festucaarundinacea)[J].Mycological Research,1991,95(9):1123-1126.

[21] Sun S.Morgan-Jones,Funk C R,White J F,Halisky P M.Endophyte-host associations in grasses.XVI.Patterns of endophyte distribution in species of the tribe agrostideae[J].American Journal of Botany,1992,79(4):472-477.

[22] 魏宇昆,高玉葆,黎川,許華,任安芝.內(nèi)蒙古中東部草原羽茅內(nèi)生真菌的遺傳多樣性[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2006,30(4):640-649.

(責(zé)任編輯 武艷培)

Effects of different medium on growth and sporulation of asexual stage ofEpichloё endophytes

LIU Li, LI Xiu-zhang, GUO Chang-hui, LI Chun-jie

(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

In the present study, six fungal strains of asexual stage ofEpichloё endophytes were isolated fromPoatibetica(Ep-003, Ep-004),Melicaprzewalskyi(Em-014, Em-016) andElymustangutorum(Ee-001, Ee-003) and were cultured on different medium including potato dextrose agar (PDA), corn meal agar (CMA), wheat straw agar (WSA) and water agar (WA). The results showed that the same strain had different colonial morphologies on different medium which had the largest colonial diameter on PDA and CMA and the smallest colonial diameter on WSA and WA after four weeks growth on medium. For the performance of different strains on the same medium, the strain of Ep-003 was fastest growing with a culture diameter of 46.42 mm on PDA whereas the strain of Em-014 was slowest growing with a culture diameter of 7.07 mm on WA. There were significant difference between sporulation on different medium(P<0.05). Ep-003 only sporulated on WA and the other five isolates sporulated more on WSA and WA than on PDA and CMA. There was no significant differences between the spore length or width on different medium except with that Em-014 had the longest spore length of 3.77 μm on WSA, and Ee-003 had the longest spore length of 8.43 μm on PDA. In terms of the length of conidiophore, there was no significant differences between the length of Ep-004, Em-016 and Ee-003 on four different medium. Em-014 had the longest length of 16.74 μm on WA and the shortest length of 14.09 μm on WSA. However, Ee-001 had the longest length of 18.59 μm on CMA and the shortest length of 13.40 μm on WSA.

symbiotic fungi; conidium; growth rate; characteristics of sporulation

LI Chun-jie E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0299

2014-06-20 接受日期：2014-10-27

國家973計(jì)劃課題(2014CB138702);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372366)第一作者:柳莉(1987-)，女，甘肅白銀人，在讀碩士生，主要從事禾草內(nèi)生真菌共生體研究。E-mail:lliu13@lzu.edu.cn

李春杰(1968-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，教授，博士，主要從事禾草內(nèi)生真菌共生體研究。 E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

S432.4+4;Q939.96

A

1001-0629(2015)06-0859-11

柳莉，李秀璋，郭長輝，李春杰.不同培養(yǎng)基對(duì)禾草內(nèi)生真菌Epichloё生長與產(chǎn)孢的影響[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):859-869.

LIU Li,LI Xiu-zhang,GUO Chang-hui,LI Chun-jie.Effects of different medium on growth and sporulation of asexual stage ofEpichloё endophytes[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：859-869.