文才華

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，南寧 530021)

HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定瀉痢寧片中秦皮甲素秦皮乙素黃芩苷和鞣花酸含量

文才華

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，南寧 530021)

目的 采用高效液相梯度洗脫法測(cè)定瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的含量。方法 Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈(4：1)，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速：1.1 mL·min-1；檢測(cè)波長λ1=334 nm(檢測(cè)秦皮甲素和秦皮乙素)，檢測(cè)波長λ2=280 nm(檢測(cè)黃芩苷)，檢測(cè)波長λ3=254 nm(檢測(cè)鞣花酸)。結(jié)果 秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸分別在0.058 6～1.172 0 μg(r=0.999 2)、0.015 4～0.308 0 μg(r=0.999 8)、0.447 2～8.944 0 μg(r=0.999 6)、0.072 6～1.452 0 μg(r=0.999 5)范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為97.24%，97.76%，98.43%，96.89%，RSD(n=6)分別為0.78%，1.11%，0.93%，0.62%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的含量控制方法。

瀉痢寧片；秦皮甲素；秦皮乙素；黃芩苷；鞣花酸

瀉痢寧片為中藥復(fù)方制劑，處方來源于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊(cè)》，由秦皮、黃芩、地錦草、地榆四味藥材組成。具有清熱燥濕、涼血解毒、止瀉止痢之功效，可用于大腸濕熱、血熱毒盛、瀉泄腹痛、下痢后重、腸炎菌痢見上述證候者的治療[1]。原部頒標(biāo)準(zhǔn)僅進(jìn)行了性狀和薄層色譜鑒別控制，未對(duì)方中的任何藥物進(jìn)行定量測(cè)定，不能有效保證產(chǎn)品的質(zhì)量和療效。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相梯度洗脫法對(duì)秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素和黃芩中黃芩苷，以及地錦草中鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀；G1322A脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A四元泵、Chemstation色譜工作站；G1315B可變波長檢測(cè)器。

1.2 試藥 秦皮甲素對(duì)照品(批號(hào)：110740-200104，純度：96.4%)、秦皮乙素對(duì)照品(批號(hào)：110741-200506，含量：98.1%)和黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201117，含量：91.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；鞣花酸對(duì)照品(批號(hào)：476-66-4，含量：98.7%)購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；瀉痢寧片(規(guī)格：每片0.42 g，批號(hào)：131011，131016，131019)購于天津格斯寶藥業(yè)有限公司；磷酸(廣州化學(xué)試劑二廠，分析純，批號(hào)：120706)；甲醇 (天津市康科德科技有限公司，色譜純，批號(hào)：1315026) ；乙腈(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司，色譜純，批號(hào)：13025006)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈(4：1)，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(0～21 min，45.0%A；>21～31 min，45.0%→20.0%A；>31～45 min，20.0%A)；流速：1.1 mL·min-1；檢測(cè)波長(0～21 min，λ1=334 nm；>21～31 min，λ2=280 nm；>31～45 min，λ3=254 nm)。該系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論板數(shù)按秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸計(jì)均不得低于2 500，分離度均應(yīng)> 2[2-10]。

2.2 樣品的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成混合對(duì)照品溶液(秦皮甲素為0.058 6 mg·mL-1，秦皮乙素為0.015 4 mg·mL-1，黃芩苷為0.447 2 mg·mL-1，鞣花酸為0.072 6 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約 2.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(300 W，40 kHz)45 min，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 按瀉痢寧片處方比例稱取除秦皮的其余藥味、除黃芩的其余藥味和除地錦草的其余藥味各一份，按瀉痢寧片的生產(chǎn)工藝分別制成缺秦皮的陰性樣品、缺黃芩的陰性樣品和缺地錦草的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺秦皮的陰性對(duì)照溶液、缺黃芩的陰性對(duì)照溶液和缺地錦草的陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、缺秦皮的陰性對(duì)照溶液、缺黃芩的陰性對(duì)照溶液以及缺地錦草的陰性對(duì)照溶液各10 μL，按上述方法測(cè)定，結(jié)果在與秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對(duì)照色譜圖中未顯示吸收峰(圖1)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5，2.5，5.0，7.5，10.0 mL置于10 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，即得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件每次進(jìn)樣20 μL測(cè)定，以峰面積(Y)與進(jìn)樣量(X)，得回歸方程為：秦皮甲素Y=2.254 7×106X+253.7，r=0.999 2；秦皮乙素Y=1.265 8×106X-398.2，r=0.999 8；黃芩苷Y=2.364 9×106X+823.8，r=0.999 6；鞣花酸Y=2.7935×106X-419.2，r=0.999 5。秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸分別在0.058 6～1.172 0，0.015 4～0.308 0，0.447 2～8.944 0，0.072 6～1.452 0 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的峰面積，RSD分別為0.75%(秦皮甲素)、0.87%(秦皮乙素)、0.39%(黃芩苷)和0.66%(鞣花酸)。結(jié)果表明儀器具有良好精密度。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，求得素皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸RSD分別為0.87%，0.42%，0.89%和0.73%。結(jié)果表明本法測(cè)定重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0，1，2，4，6，8 h后，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積值，求得秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸RSD分別為0.69%、0.53%、0.36%和0.75%。結(jié)果表明供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批瀉痢寧片(秦皮甲素為1.462 mg·g-1，秦皮乙素為0.386 mg·g-1，黃芩苷為11.24 mg·g-1，鞣花酸為1.826 mg·g-1)10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約 1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL、用75%甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見表1。

A.對(duì)照品；B.供試品；C.缺秦皮陰性對(duì)照品；D.缺黃芩陰性對(duì)照品；E.缺地錦草陰性對(duì)照品；1.秦皮甲素；2.秦皮乙素；3.黃芩苷；4.鞣花酸

圖1 5種溶液的HPLC色譜圖

A.reference substance；B.samples；C.negative control without fraxini cortex；D.negative control without scutellariae radix；E.negative control without euphorbiae humifusae herba；1.aesculin；2.aesculetin；3.baicalin；4.ellagic acid

Fig.1 HPLC chromatogram of five kinds of solutions

2.4 樣品測(cè)定 取3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定本品每片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸含量，結(jié)果見表2。

表2 每片樣品中4種成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

取秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對(duì)照品各適量，分別加75%甲醇溶解制成每毫升含0.04 mg的溶液，在波長200～400 nm處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果秦皮甲素和秦皮乙素對(duì)照品溶液均在334.1 nm處有最大吸收，黃芩苷對(duì)照品溶液在280 nm處有最大吸收，鞣花酸對(duì)照品溶液在254 nm處有最大吸收。故選擇334 nm作為秦皮甲素和秦皮乙素的測(cè)定波長，280 nm作為黃芩苷的測(cè)定波長，254 nm作為鞣花酸的測(cè)定波長。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所采用的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的質(zhì)量控制方法。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.027

Simultaneous Determination of Four Ingredients inXieliningTablets by HPLC

WEN Caihua

(DepartmentofPharmacy,theAffiliatedTumourHospital，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China)

Objective To develop a HPLC method for determination of aesculin， aesculetin，baicalin and ellagic acid inXieliningtablets. Methods The hypersil C18column was used with the flow rate of 1.1 mL·min-1.The mobile phase A consisted of methanol-acetonitrile(4：1)，the mobile phase B consisted of 0.1% phosphoric acid solution; The detection wavelengths wereλ1=334 nm(aesculin and aesculetin),λ2=280 nm(baicalin),andλ3=254 nm(ellagic acid). Results There was a good linear relationship between the peak area values and concentrations of aesculin，aesculetin，baicalin and ellagic acid.The quantitation range of aesculin，aesculetin，baicalin and ellagic acid was 0.058 6-1.172 0 μg(r=0.999 2), 0.015 4-0.308 0 μg(r=0.999 8),0.447 2-8.944 0 μg(r=0.999 6),and 0.072 6-1.452 0 μg(r=0.999 5), respectively.The average recovery was 97.24%(RSD=0.78%)，97.76%(RSD=1.11%)，98.43%(RSD=0.93%) and 96.89%(RSD=0.62%), respectively. Conclusion The method is convenient，accurate，sensitive，reproducible and may be used in the determination of aesculin， aesculetin，baicalin and ellagic acid inXieliningtablets.

Xieliningtablets; Aesculin; Aesculetin; Baicalin; Ellagic acid

2013-12-08

2014-01-20

文才華(1971-)，男，湖北孝感人，主管藥師，學(xué)士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)和藥品質(zhì)量控制工作。E-mail:wencaihualunwen@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0384-04