郭凝，王玉，趙明日，龔雪琴，孫力

海生紅藻多管藻中藻膽蛋白的分離純化

郭凝，王玉，趙明日，龔雪琴，孫力

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264000)

選用Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)、Fine Sephadex G-150(FG-150)以及Sephacryl S-300(S-300)3種凝膠過濾對(duì)富含R-藻紅蛋白(R-PE)的多管藻藻膽蛋白提取液進(jìn)行R-PE、R-藻藍(lán)蛋白(R-PC)和別藻藍(lán)蛋白(AP)的分離，并對(duì)所得R-PE、R-PC/AP組分用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析做進(jìn)一步純化，優(yōu)化建立了從多管藻藻膽蛋白提取液中同時(shí)有效分離純化R-PE、R-PC和AP 3類藻膽蛋白組分的技術(shù)方法.

層析;聚丙烯酰胺凝膠電泳;多管藻;藻紅蛋白;藻藍(lán)蛋白;別藻藍(lán)蛋白

藻膽蛋白是廣泛存在于藍(lán)藻、紅藻、部分隱藻中的一類水溶性的色素蛋白［1-2］，主要功能是捕獲和傳遞光能，使光合作用得以發(fā)生［3］.根據(jù)其光譜特性，主要分為藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅藍(lán)蛋白［4-5］.作為熒光探針與光敏化劑，藻膽蛋白在生物、醫(yī)學(xué)熒光標(biāo)記分析與光敏化抗腫瘤研究等方面應(yīng)用廣泛［6-8］，無毒及鮮亮的顏色也使其在食品和化妝品中得以應(yīng)用［9-10］.藻膽蛋白在各領(lǐng)域應(yīng)用的進(jìn)展依賴于對(duì)其結(jié)構(gòu)和光譜特性的全面了解［11］，因此藻膽蛋白的分離純化一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的研究?jī)?nèi)容［12］.在紅藻藻膽體中，藻紅蛋白(R-phycoerythrin，R-PE)、藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin R-PC)和別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin AP)總量的相對(duì)比例可高達(dá)(6～8)∶1∶1，這使R-PE對(duì)RPC，尤其是AP的分離純化產(chǎn)生很大干擾，成為遲滯國(guó)內(nèi)外海生大型紅藻藻膽體，尤其是“核”結(jié)構(gòu)域及藻藍(lán)、別藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的瓶頸因素［13-15］.

藻膽蛋白分離純化的方法最早由Glazer和 Fang基于分離血紅蛋白亞基的方法而創(chuàng)立［16-17］.目前，在多管藻Polysiphonia urceolata藻膽蛋白的相關(guān)研究中所用的分離純化方法各有不同.例如:使用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析一步制備R -PE［18］;用羥基磷灰石和凝膠過濾層析分離純化R -PE［19］和R-PC［20］;用DEAE離子交換纖維素和凝膠過濾分離純化R-PE［21］.第一步選用結(jié)合性層析雖然有通量大的優(yōu)點(diǎn)，但由于高含量R-PE對(duì)R -PC尤其是AP組分的影響，很難同時(shí)跟蹤到RPE、R-PC及AP分離組分，實(shí)現(xiàn)3類藻膽蛋白的同時(shí)分離純化.

根據(jù)六聚體(αβ3Υαβ3)R-PE(240 ku)與三聚體(αβ3)R-PC(136 ku)或AP的分子大小差別，先順序使用3種類型的凝膠過濾分離多管藻中的RPE和R-PC/AP，可以從高含量R-PE、低含量R -PC和AP的藻膽蛋白提取液中非常有效地制備出R-PE和R-PC/AP組分.這為R-PE，尤其是R-PC和AP的進(jìn)一步純化創(chuàng)造了有利條件［14］.以本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作［14-15，21-23］為基礎(chǔ)，本研究選用2種Sephadex G-150凝膠過濾從多管藻藻膽蛋白提取液中分離R-PE和R-PC/AP組分，選用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析分別從凝膠過濾所得R-PE及R-PC/AP組分中進(jìn)一步純化制備R-PE、R-PC及AP組分，建立同時(shí)進(jìn)行R -PE、R-PC及AP 3類藻膽蛋白分離純化的層析技術(shù)方法.所建立的技術(shù)方法可用于海生大型紅藻R-PE、R-PC及AP的有效分離與純化，有利于促進(jìn)大型紅藻藻膽蛋白，尤其是低含量R-PC和AP的結(jié)構(gòu)功能研究.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用的多管藻(Polysiphonia urceolata Grev)是一種生活在較低溫度(5～15℃)環(huán)境中、煙臺(tái)當(dāng)?shù)睾Ｓ蛞子诓杉暮Ｉ笮图t藻.多管藻藻體為紅褐色，長(zhǎng)絲狀，手感滑膩，密集叢生，呈毛發(fā)狀.多生長(zhǎng)于低潮帶的巖石或鹽沼地帶，每年2月-4月為其生長(zhǎng)旺期.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻膽蛋白樣品制備樣品的前期處理與王玉在前期報(bào)導(dǎo)中所使用的方法類似［14］，將采集的新鮮多管藻用海水洗凈，經(jīng)過磷酸緩沖液浸泡，抽濾、離心取上清液，使用超濾膜包截留、濾出部分雜蛋白并將提取液濃縮至一定濃度后避光、冷藏保存，用于凝膠過濾.

1.2.2 凝膠過濾層析R-PC組分的凝膠過濾選用2種顆粒大小不同的葡聚糖凝膠(5～300 ku): Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)和Fine Sephadex G-150(FG-150)(柱床3.7 cm×58 cm)進(jìn)行多管藻藻膽蛋白提取液中R-PE與R-PC/ AP組分的分離.

R-PE組分的凝膠過濾選用2種分子大小分離范圍不同的MFG-150與Sephacryl S-300(S-300)(10～1 500 ku、4 cm×58 cm)進(jìn)行，以除去RPE組分中所含的分子較大的雜質(zhì).

凝膠過濾時(shí)用280 nm光吸收(A280)實(shí)時(shí)檢測(cè)、記錄洗脫曲線.通過分部收集樣品在498 nm、618 nm和650 nm的光吸收跟蹤、檢測(cè)R-PE、R-PC和AP.根據(jù)洗脫曲線，以A498/A618和A565/A280值為參照，收集完整洗脫峰內(nèi)的R-PE、R-PC/AP組分，并用50 ku超濾膜包將所得樣品濃縮至A498＞16、A618＞4.5.避光、冷藏保存濃縮R-PE、R-PC/AP樣品，用于R-PE、R-PC/AP的進(jìn)一步分離純化.

1.2.3 離子交換層析選用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析，分別對(duì)凝膠過濾收集的RPE、R-PC/AP樣品進(jìn)行純化.

R-PC/AP離子交換層析的條件與曲艷在前期報(bào)導(dǎo)中所使用的方法類似［23］.柱床為1.2 cm×5.0 cm，以7.5～8 cm/h流速、A618＞2的樣品10 mL上樣，15.5～16 cm/h流速洗脫，所用NaCl梯度范圍為50～200 mmol/L.

R-PE離子交換層析使用50 mM PBS緩沖液平衡柱床(2.0 cm×7.0 cm)，以4.5～5 cm/h流速、A498＞4的樣品20 mL上樣，9.5～10 cm/h流速洗脫，所用NaCl梯度范圍為0～250 mmol/L.

離子交換層析時(shí)用280 nm光吸收(A280)實(shí)時(shí)檢測(cè)、記錄洗脫曲線.通過分部收集樣品在498 nm、618 nm和650 nm的光吸收跟蹤、檢測(cè)R-PE、RPC、AP.參照A565/A280、A498/A618和A618/A650值，收集完整洗脫峰內(nèi)的R-PE、R-PC和AP組分.用50 ku超濾膜包將所得樣品濃縮至A498＞16、A618＞7.避光、冷藏保存濃縮R-PE、R-PC和AP樣品.

1.2.4 光譜測(cè)定用UV-1900型紫外可見分光光度計(jì)，在pH 7.0磷酸緩沖液中檢測(cè)各分離純化階段樣品在498 nm、618 nm、650 nm光吸收值，并測(cè)定得樣品在250～750 nm的吸收光譜.

1.2.5 凝膠電泳藻膽蛋白Aλmax與A280的比值，是純化標(biāo)準(zhǔn)之一.R-PE與R-PC的純度除了反映在A565/A280和A618/A280的比值上，還需通過非變性聚丙烯酰凝膠電泳(Native-PAGE)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行驗(yàn)證.

Native-PAGE的實(shí)驗(yàn)方法與王玉在前期報(bào)導(dǎo)中的方法［24］類似，選擇Bis-Tris Hepes的電泳體系，穩(wěn)流方式電泳.電泳結(jié)束后，用UVP-Biospectrum Imaging System凝膠成像系統(tǒng)分別記錄在365 nm紫外光下的熒光帶與考染結(jié)果.

SDS-PAGE與趙明日在R-PE多肽組成分析中［25］的方法類似，選擇Tris-HCl的電泳體系，分離膠濃度為13%與16%，分離膠緩沖液為0.8 mol/L與1.5 mol/L Tris-HCl，分別用來進(jìn)行R-PE和R -PC的電泳.記錄在365 nm紫外光下的熒光帶與考染結(jié)果.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藻紅、藻藍(lán)、別藻藍(lán)蛋白組分的凝膠過濾分離

藻膽蛋白提取液(A498=7.51，根據(jù)R-PE在498 nm的光吸收系數(shù)K498=4.89mL/(mg· cm)［26］，R-PE含量為1 536 μg/mL，A498/A618= 6.44)的MFG-150、FG-150凝膠過濾結(jié)果如圖1所示.由A618和A650分別跟蹤、檢測(cè)的R-PC和AP 2種藻膽蛋白的洗脫曲線完全重疊(圖1中b).RPE位于R-PC和AP組分的前面(圖1中a).在R -PC和AP組分之后為小分子R-藻紅蛋白(SRPE)［14］(圖1中c).

圖1 藻膽蛋白提取液的凝膠過濾洗脫曲線Fig.1 Elution curves of the extracted phycobiliprotion gel filtration

如圖1 A、B所示，與MFG-150相比，F(xiàn)G-150對(duì)R-PC/AP與R-PE、R-PC/AP與SR-PE有著更高的分離度，表明FG-150相比MFG-150對(duì)R-PE與R-PC/AP組分有著更好的分離效果，其中R-PC/AP組分更為明顯.

為保證R-PC/AP組分的回收率，經(jīng)2種G-150凝膠過濾得到的R-PC/AP組分中不可避免地仍會(huì)含有部分R-PE和SR-PE成分.因此，選擇分離度相對(duì)較高的FG-150，對(duì)所收集的R-PC/ AP組分進(jìn)行再次純化(圖2 A、B).

MFG-150和FG-150凝膠過濾所得R-PE組分中仍含有少量R-PC和分子大于R-PE的雜蛋白成分.在此，選擇分離范圍較大的S-300層析柱對(duì)所收集的R-PE組分進(jìn)行再一次純化(圖2 C).

如圖2 A、B所示，經(jīng)FG-150凝膠過濾所得的R-PC/AP組分與經(jīng)MFG-150凝膠過濾所得的R -PC/AP組分相比，在第2次FG-150凝膠過濾中，R-PE和SR-PE的峰值前者(圖2 A)均比后者(圖2 B)低.但從表1中可以看出，最終所得PC/ AP組分的A618/A280與A618/A498比值差別不大，說明2種純化途徑，G-150→FG-150和FG-150→FG -150，均可得到理想的R-PC/AP組分分離效果.與順序使用MFG-150、S-300、S-200凝膠過濾［14］相比，本實(shí)驗(yàn)所得R-PC/AP組分的A618/A280與A618/A498比值(表1)均有提高，表明分離效率更高.

圖22 種R－PC組分的FG－150凝膠過濾與R－PE組分的S－300凝膠過濾洗脫曲線Fig.2 Gel filtration elution curves of the two R-PC fractions on FG-150 gel and the R-PE fraction on

如圖2 C所示，在R-PE組分的S-300洗脫曲線上沒有表現(xiàn)明顯出雜蛋白峰，但A565/A280比值從MFG-150/FG-150 R-PE組分的3.72/3.81增加到4.18(表1)，表明仍有雜蛋白成分被除去.

表1 純化流程中所收集的各個(gè)組分的光吸收變化Tab.1 The light absorption ratio variation of all fractions obtained in the purification process

2.2 藻紅、藻藍(lán)、別藻藍(lán)蛋白組分的離子交換層析純化

選用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析進(jìn)行凝膠過濾所得R-PE、R-PC/AP組分的進(jìn)一步純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

如圖3 A所示，凝膠過濾所得R-PC/AP組分經(jīng)梯度洗脫(50～200 mmol/L NaCl)，分離出在618 nm有特征吸收的R-PC(圖3 A中a)和在650 nm有特征吸收的AP(圖3 B中b)2個(gè)組分.300 mmol/ L NaCl洗脫組分(圖3 A中c)在650 nm與498 nm處均有吸收，但618 nm吸收相對(duì)較低.600 mmol/L NaCl洗脫組分(圖3 A中d)，在498 nm仍有較高吸收但在650 nm與618 nm處已幾乎沒有吸收.收集R-PC(圖3 A中a)與AP(圖3 A中b、圖3 A中c)組分，光吸收比值列于表1中.

如圖3 B所示，凝膠過濾所得R-PE組分在離子交換層析中只出現(xiàn)1個(gè)R-PE洗脫峰.300 mmol/L NaCl洗脫所得組分已沒有明顯的R-PE吸收.收集R-PE組分其光吸收比值如表1所示.

如表1和圖4所示，經(jīng)陰離子交換層析后的R -PE組分A565/A280＞4.5，R-PC組分A618/A280＞4.0，均已達(dá)到藻膽蛋白的純化標(biāo)準(zhǔn)［23］.但AP組分的吸收光譜(圖4 C)表明其中仍含有R-PC和少量R-PE成分，說明單純使用本實(shí)驗(yàn)中的層析方法還無法獲取到純度較高的AP組分［24］.

圖3 R－PE與R－PC/AP組分的DEAE-Sepharose FF離子交換層析洗脫曲線Fig.3 Elution curves of the ion exchange chromatography of the R-PE and R-PC/AP fractions on DEAE-Sepharose FF

圖4 分離純化過程中所得各組分的吸收光譜變化Fig.4 The absorption spectrum variation of all fractions obtained in the purification process

2.3 藻膽蛋白組分的電泳分析

熒光結(jié)果如圖5 A所示，藻膽蛋白提取液(泳道1)365 nm下有黃色和紅色2條熒光帶，其中R-PE的黃色熒光帶較強(qiáng)，R-PC的紅色熒光帶較弱.泳道2的R-PC樣品紅色熒光帶相比泳道1明顯減弱，說明R-PC含量已經(jīng)明顯減小.泳道4粗樣R -PC有明顯的紅色熒光帶，說明已含有較高含量的R-PC.

考染結(jié)果如圖5 B所示，藻膽蛋白提取液(泳道1)中含有較多在熒光結(jié)果中沒有顯示的無色條帶，說明其含有較多無色雜蛋白.泳道3與泳道5中的純化R-PE與R-PC與熒光結(jié)果相對(duì)應(yīng)，沒有其他條帶，說明純化后的R-PE與R-PC組分已有較高的純度.

圖5 藻膽蛋白提取液、凝膠過濾及離子交換所得R-PE與R-PC/AP組分的Native-PAGEFig.5 The Native-PAGE of the extracted phycobiliprotion solution and the fractions of R-PE and R-PC/AP from gel filtrations and ion-exchange chromatography

如圖6所示，從鋅染與考染結(jié)果的對(duì)比可以看出，兩者的條帶基本相對(duì)應(yīng)，說明純化后的R-PE與R-PC不存在其他無色多肽.電泳分析結(jié)果表明，經(jīng)2次凝聚過濾和離子交換分離、純化制備的R -PE和R-PC達(dá)到了用于其結(jié)構(gòu)、功能研究的純度要求.

圖6 純化R-PE與R-PC組分的SDS-PAGEFig.6 The SDS-PAGE of the purified R-PE and R-PC

3 討論

本研究選用了MFG-150和S-300、MFG-150和FG-150 2種不同的凝膠過濾層析劑，從富含R-PE的多管藻藻膽蛋白提取液中分離R-PE和R-PC/AP組分.結(jié)果(圖1、2)證明，順序使用MFG-150和S-300、MFG-150和FG-150進(jìn)行2次凝膠過濾可以有效分離制備R-PE和R-PC/ AP組分.與選用MFG-150、S-300和S-200進(jìn)行3次凝膠過濾分離制備R-PE和R-PC、AP組分［14］相比，所得R-PC/AP組分的光吸收比值，如A618/A280與A618/A498(表1)優(yōu)于前者，且可省去1次凝膠過濾.MFG-150和FG-150組合有利于分離制備R-PC/AP組分的主要原因是細(xì)顆粒FG-150凝膠減小了層析樣品帶在層析過程中的縱向展寬，從而有效提高了柱效率和R-PE與R-PC/AP、R -PC/AP和S-R-PE之間的分離度.

以凝膠過濾分離所得R-PE和R-PC/AP組分為基礎(chǔ)，用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析分別進(jìn)一步分離純化R-PE、R-PC和AP組分.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換層析可以有效純化制備R-PE、RPC和AP組分，而且光吸收比值(表1)、吸收光譜(圖4)及凝膠電泳分析(圖5、6)證明，離子交換層析制備的R-PE和R-PC成分具有較高的、符合藻膽蛋白結(jié)構(gòu)功能研究和用作熒光探針的純度.然而，所得AP組分仍含有R-PC和R-PE成分(圖4 C).雖然所得AP組分由于總量小不適合再用層析純化，但其所富含的AP成分已可以用非變性凝膠電泳進(jìn)行有效制備［24］.由各個(gè)步驟中所收集的R -PE與R-PC/AP組分特征吸收峰的吸光值與上樣樣品的該特征吸收峰的吸光值的比值所計(jì)算得出，R-PE、R-PC與AP的收集率約為28.8%、18.2%、22.5%.根據(jù)R-PE的光吸收系數(shù)［26］可以算出，每100 g多管藻中可純化出約96 mg的RPE.

本研究以作者實(shí)驗(yàn)室前期研究工作為基礎(chǔ)，依次使用MFG-150和S-300、MFG-150和FG-150凝膠過濾，從富含R-PE的多管藻藻膽蛋白提取液中分離R-PE和R-PC/AP，然后利用DEAE Sepharose-Fast Flow離子交換從所得R-PE和R -PC/AP組分中純化制備R-PE、R-PC和AP成分.在紅藻藻膽蛋白分離純化中，目前最普遍的是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程中僅分離純化一種藻膽蛋白;與此相比，本研究建立了在一個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中同時(shí)進(jìn)行R-PE、R-PC和AP 3類藻膽蛋白成分的有效分離、純化的技術(shù)方法.而且，通過增加超濾膜包的面積，將凝膠過濾柱直徑擴(kuò)大至約10 cm、離子交換柱直徑擴(kuò)大至約3.5 cm便可以將R-PE的制備量增大到約500 mg.本實(shí)驗(yàn)報(bào)道的技術(shù)方法不僅可用于其他富含R-PE海生大型紅藻中藻膽蛋白的分離純化，而且有利于深化大型紅藻R-PC和AP的結(jié)構(gòu)、功能及其在藻膽體中的有序組裝等方面的研究.

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Isolation and Purification of Phycobiliproteins from Marine Red Alga Polysiphonia urceolata

GUO Ning，WANG Yu，ZHAO Ming-ri，GONG Xue-qin，SUN Li
(School of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，China)

R-phycerythrin(R-PE)，R-phycocyanin(R-PC)and allophycocyanin(AP)are isolated from the extracted phycobiliprotein solution of Polysiphonia urceolata rich in phycoerythrin using gel filtration through Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)，F(xiàn)ine Sephadex G-150(FG-150)and Sephacryl S-300(S-300).The obtained fractions of R-PE，R-PC and AP are further purified using ion-exchange chromatography through DEAE Sepharose-Fast Flow.An optimized technical procedure for simultaneous preparation of the three phycobiliprotein types from the extracted phycobiliproteins of Polysiphonia urceolata is established based on the present experiments.

chromatography;polyacrylamide gel electrophoresis;Polysiphonia urceolata Grev;phycoerythrin;phycocyanin;allophycocyanin

Q503

A

(責(zé)任編輯 周雪瑩)

1004-8820(2015)03-0179-07

10.13951/j.cnki.37-1213/n.2015.03.006

2014-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30571720，40976083).

郭凝(1987-)，男，山東煙臺(tái)人，碩士研究生.

孫力(sunliytu@aliyun.com)，教授，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué).