張朝升，王競茵，榮宏偉，鄧 杰，黃小鵬，江秀賢，伍志趼

（1.廣州大學(xué)省部共建教育部珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.廣州市凈水有限公司，廣東廣州 510655）

熒光定量PCR監(jiān)測抑制劑對(duì)低溫SBR微生物的影響

張朝升1，王競茵1，榮宏偉1，鄧 杰1，黃小鵬2，江秀賢2，伍志趼2

（1.廣州大學(xué)省部共建教育部珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.廣州市凈水有限公司，廣東廣州 510655）

為研究氯酸鹽抑制劑對(duì)SBR活性污泥中微生物的影響，采用序批式活性污泥反應(yīng)器（SBR），在低溫（15℃）條件下通過向反應(yīng)器定時(shí)投加氯酸鹽抑制劑，成功抑制系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的活性，氨氮去除率和亞硝酸鹽積累率均達(dá)到90%以上，實(shí)現(xiàn)了城市污水短程硝化的快速啟動(dòng).采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)氨氧化菌（AOB）、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）和總細(xì)菌進(jìn)行菌群定量分析，分析結(jié)果表明，氯酸鹽抑制劑對(duì)NOB具有選擇抑制性，對(duì)AOB的活性沒有明顯影響，而對(duì)NOB的活性抑制在短時(shí)間內(nèi)是不可恢復(fù)的.

氯酸鹽；NOB抑制；短程硝化

短程硝化反硝化生物脫氮（Biological Nitrogen Removal via Nitrite）又稱為不完全或簡捷硝化－反硝化生物脫氮.該工藝將硝化過程控制在階段，隨后提供碳源進(jìn)行反硝化.SBR工藝優(yōu)于傳統(tǒng)硝化反硝化工藝的優(yōu)點(diǎn)：省去了由氧化為和反硝化時(shí)由還原為的兩個(gè)過程，從而在理論上可節(jié)省25%的曝氣量和40%的反硝化碳源［1］（以CH3OH為反硝化碳源計(jì)）.短程硝化反硝化工藝是目前生物脫氮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).利用硝化過程中限制性或抑制因素使亞硝酸氧化菌受到抑制，能夠抑制亞硝酸的氧化速率，從而達(dá)到亞硝酸積累的目的.

由于硝化細(xì)菌的生長速率較低，生物量較少，采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)平板技術(shù)方法研究其數(shù)量的變化非常費(fèi)時(shí)、繁瑣［2］.目前，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)污水生物反應(yīng)器中的功能菌屬進(jìn)行定量分析［3－5］.與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和FISH技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度高、重現(xiàn)性好，同時(shí)處理的樣品量大等特點(diǎn)［6］.實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用監(jiān)測指數(shù)擴(kuò)增期內(nèi)每個(gè)循環(huán)后熒光信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算出達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），將Ct值與標(biāo)準(zhǔn)值的Ct值相比較，利用已知標(biāo)準(zhǔn)值的量，計(jì)算出目的基因的拷貝數(shù)，達(dá)到在相同的反應(yīng)條件下檢測投加氯酸鹽抑制劑后不同時(shí)期樣品中特定微生物的數(shù)量變化［7］.

張?zhí)m河等利用序批式活性污泥反應(yīng)器研究NaCl濃度對(duì)短程硝化反硝化的影響，得到實(shí)現(xiàn)短程硝化的最佳鹽度范圍為5.8 g·L－1～25.0 g· L－1.因此，本實(shí)驗(yàn)以城市污水為研究對(duì)象，采用序批式反應(yīng)器（SBR）在低溫（15℃）條件下通過連續(xù)性投加ρ（NaCl）為6 g·L－1的氯酸鈉抑制劑培養(yǎng)短程硝化活性污泥，驗(yàn)證氯酸鹽對(duì)NOB的選擇抑制性，并且利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)活性污泥中硝化細(xì)菌（AOB和NOB）種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為氯酸鹽對(duì)硝化細(xì)菌的抑制現(xiàn)象提供微生物層面的驗(yàn)證.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

序批式反應(yīng)器（SBR）裝置見圖1.反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，直徑約20 cm，圓柱體高約44 cm，圓臺(tái)型底部，高10 cm，總?cè)莘e13 L，其中有效容積為12 L.反應(yīng)器運(yùn)行的步驟：先進(jìn)水，待進(jìn)水結(jié)束后開始曝氣，曝氣和沉淀時(shí)間分別為8 h和4 h，然后再排水和放置，進(jìn)入下一個(gè)周期.在反應(yīng)器側(cè)壁垂直方向上每隔一定距離設(shè)置取樣口（兼排水），底部設(shè)有進(jìn)水管和放空排泥管；采用氣泵曝氣、轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)氣量、粘砂塊作為微孔曝氣器；反應(yīng)器內(nèi)設(shè)置溫度保持在37℃左右.高位水箱有效容積40 L，每次試驗(yàn)用水通過提升泵提升至水箱內(nèi)；在反應(yīng)器中裝有DO、ORP和pH傳感器，在線監(jiān)測反應(yīng)過程中DO、ORP和pH的變化.

圖1 SBR反應(yīng)器示意圖Fig.1 Schematic representation of the SBBR

將接種污泥經(jīng)沉淀排除上清液后加入反應(yīng)器內(nèi)，同時(shí)加入人工配置的模擬生活污水并連續(xù)曝氣，進(jìn)水COD濃度約150 mg·L－1左右、氨氮濃度50 mg·L－1左右、pH值7.0左右、水溫保持15℃左右，曝氣量控制在0.3 m3·h－1，曝氣時(shí)間6 h，每天2次［8］.每次開始曝氣前，都換新鮮的污水，排泥維持污泥濃度為3 200 mg左右.每次換水后加入6 g·L－1氯酸鈉抑制劑，每隔2 d取1次反應(yīng)器靜止時(shí)的活性污泥，準(zhǔn)確稱取污泥100 m用于提取DNA.

1.2 DNA提取

采用上海博彩生物試劑公司K717環(huán)境基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA［9］.利用美國quawell Q3000超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA提取效果及其濃度.

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，其中1 μL DNA模板加24 μL反應(yīng)液，反應(yīng)液包括12.5 μL Taq DNA聚合酶（TAKARA公司，大連），9.5 μL PCR-buffer（Applied Biosystems應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）、正反向引物各1 μL.引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測后均可得到清晰的目標(biāo)條帶.將含有目的基因的片段切下，用BIORAD公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并測定其濃度.

用TAKARA公司生產(chǎn)的pMD18-T載體試劑盒，在微量離心管中制備下列連接反應(yīng)液，反應(yīng)液為10 μL，其中連接液1 μL載體1 μL，目的基因3 μL，純凈水5 μL，混合后在16℃恒溫箱中水浴1 h.

取100 μL制備好的大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)菌（TAKARA公司，大連），加入2.4 μL連接反應(yīng)液，溫和混勻，冰上放置30 min，再將離心管放到42℃水浴70 s進(jìn)行熱休克，迅速放回冰中，將細(xì)胞冷卻4 min后加入1 mL SOC培養(yǎng)液于每支離心管中，置于37℃搖床（200 r·min－1）培養(yǎng)50 min.培養(yǎng)后的菌液先提取100 μL上清液作為低濃度進(jìn)行涂板，再加上含氨芐青霉素，于37℃溫箱培養(yǎng)約16 h，進(jìn)行下一步操作.

陽性轉(zhuǎn)化子復(fù)篩與鑒定：用無菌牙簽挑取少量白色菌落放入含氨芐青霉素（濃度為5 mg·mL－1）的LB培養(yǎng)液試管中，放置37℃搖床（200 r· min－1）培養(yǎng)12～16 h，最后將菌液送華大基因研究院提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證［9］.

1.4 熒光定量PCR

將目標(biāo)細(xì)菌測序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒作為本研究的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品使用.經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒的純度和濃度，根據(jù)公式計(jì)算DNA拷貝數(shù)［10］.計(jì)算公式：

式中，m為1拷貝DNA分子的堿基對(duì)數(shù)，bp每個(gè)；w為1個(gè)堿基對(duì)的道爾頓數(shù)，660 Daltons bp－1；CDNA為DNA濃度，ng·μL－1.

計(jì)算得出DNA拷貝數(shù)后，將重組質(zhì)粒按10倍梯度稀釋用作標(biāo)準(zhǔn)樣品［11］.每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均值.根據(jù)建立的反應(yīng)閥值（cycle threshold，Ct值）與DNA濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算未知樣品中目標(biāo)菌群的菌群數(shù)量.

本實(shí)驗(yàn)每次使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有很好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)為0.99以上），PCR擴(kuò)增效率超過90%.其中氨氧化菌定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2.擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖3、圖4，圖中擴(kuò)增曲線平滑，樣品重復(fù)性好.溶解曲線顯示擴(kuò)增特異性較好，沒有非特異擴(kuò)增的峰值，定量PCR結(jié)果可信.

圖2 氨氧化菌定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of AOB for Real-time PCR

圖3 氨氧化菌定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.3 The amplification plot of AOB for Real-time PCR

圖4 氨氧化菌定量PCR溶解曲線Fig.4 The melt curve of AOB for Real-time PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系：擴(kuò)增體系為25 μL，包括12.5 μL 1×SYBR Green PCR master mix（Applied Bio-systems），9.5 μL PCR-buffer（Applied Biosystems，美國）、正反向引物各1 μL.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增對(duì)應(yīng)目標(biāo)菌群、引物序列和反應(yīng)條件見表1.

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行效果

本研究通過1 d 1次添加氯酸鈉抑制劑（投加量6 g·L－1）的方法快速啟動(dòng)SBR活性污泥反應(yīng)器.實(shí)驗(yàn)初期，SBR運(yùn)行周期中沉淀時(shí)間控制在50 min，這樣能防止污泥流失，保持反應(yīng)器內(nèi)較高的污泥濃度.反應(yīng)溫度為15±0.5℃，每天排泥維持污泥濃度為3 200 mg左右，曝氣量為0.3 m3·h－1的穩(wěn)定狀態(tài)下運(yùn)行1個(gè)多月，反應(yīng)器在不同運(yùn)行時(shí)期的三氮濃度和亞硝酸鹽積累率變化曲線見圖5.亞硝酸鹽積累率就是亞硝酸含量占整個(gè)含氮量的百分比.

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物與反應(yīng)條件Table 1 Primers and parameters of Real-time PCR

反應(yīng)器啟動(dòng)初期，投加氯酸鈉抑制劑的前8 d，NO2－N濃度直線上升，亞硝酸鹽積累率在第10 d達(dá)到小高峰.反應(yīng)器啟動(dòng)10～16 d，NO2－N濃度和NO3－N濃度處于波動(dòng)狀態(tài)，說明該時(shí)期抑制劑對(duì)NOB的活性抑制尚不穩(wěn)定，出現(xiàn)NO3－N輕微上升的階段.繼續(xù)投加氯酸鈉，在反應(yīng)器運(yùn)行23 d后，SBR反應(yīng)器內(nèi)氨氮去除率達(dá)到80%以上，亞硝酸鹽積累達(dá)到90%左右，說明利用氯酸鈉抑制劑在低溫（15℃）條件下SBR實(shí)現(xiàn)了短程硝化的啟動(dòng).第24～29 d期間，反應(yīng)器內(nèi)亞硝酸鹽濃度保持在17～20 mg·L－1，反應(yīng)器內(nèi)亞硝酸鹽氧化菌處于穩(wěn)定抑制階段.

圖5 反應(yīng)器運(yùn)行效果圖Fig.5 Water quantity of the influent，effluent andconcentration

反應(yīng)器運(yùn)行第30 d后，停止投加氯酸鈉抑制劑，根據(jù)反應(yīng)器停止投藥后15 d的運(yùn)行狀況（見圖6），NO3－N濃度并沒有明顯的波動(dòng)，NO2－N濃度也維持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài).同時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)氨氮去除率保持80%以上，亞硝酸鹽積累達(dá)到90%左右，這表明了氯酸鈉抑制劑對(duì)NOB的活性抑制在短時(shí)間內(nèi)是不可恢復(fù)的.

早在1945年就有報(bào)道稱氯酸鹽能夠抑制NOB的硝化效果，而對(duì)AOB的氨氧化作用沒有影響［14］.也有研究在泥土、沉淀物等系統(tǒng)中驗(yàn)證了氯酸鹽對(duì)NOB的選擇抑制性，并確定了氯酸鹽對(duì)NOB的抑制范圍［15－16］.本實(shí)驗(yàn)采用氯酸鈉抑制劑，投加濃度為3.6 mmol L－1，該濃度的氯酸鹽抑制劑能有效提高亞硝酸鹽積累率，抑制NOB的生長活性.如圖5所示，NH4－N濃度和NO3－N濃度隨著亞硝酸鹽積累率的提高逐漸下降，說明氯酸鹽抑制劑對(duì)AOB沒有影響.

2.2 抑制階段氯酸鹽對(duì)微生物群落的影響

短程硝化控制一定程度上取決于對(duì)AOB和NOB兩種硝化菌的控制，在生理機(jī)制及動(dòng)力學(xué)特征上存在固有的差異，導(dǎo)致某些影響因素對(duì)兩種硝化細(xì)菌存在不同程度的抑制作用，從而影響硝化形式［17］.利用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)所具有的較高靈敏度和精確度，通過監(jiān)測投加氯酸鹽抑制劑后活性污泥中AOB和NOB含量的變化規(guī)律，從而研究氯酸鹽在固定濃度下對(duì)兩種硝化細(xì)菌不同程度的抑制作用.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SBR內(nèi)不同運(yùn)行時(shí)期的總細(xì)菌、氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量分析，分別測定樣品中總細(xì)菌16S rDNA、NOB和AOB的拷貝數(shù).結(jié)果見表2.

如表2所示，各類功能菌的數(shù)量在SBR不同的運(yùn)行時(shí)期具有一定的變化規(guī)律，其變化規(guī)律與反應(yīng)器的出水水質(zhì)效果的變化規(guī)律相符.在運(yùn)行初期，AOB比NOB的數(shù)量少了2個(gè)數(shù)量級(jí)，由于本實(shí)驗(yàn)SBR系統(tǒng)接種污泥為城市污水處理廠二沉池的活性污泥，氨氮去除率約54%.經(jīng)過接種馴化培養(yǎng)后，本研究反應(yīng)器中AOB數(shù)量持續(xù)上升，從7.43×108（第4 d）下降到1.05×109（第28 d）. NOB數(shù)量受到抑制生長，反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定時(shí)（第28 d）NOB數(shù)量是運(yùn)行初期的1／138，亞硝酸鹽積累度也達(dá)到90%以上，說明該序批式活性污泥短程脫氮系統(tǒng)已經(jīng)成功建立.

表2 抑制階段污泥樣品中各類菌群定量監(jiān)測數(shù)據(jù)（拷貝數(shù)每ng干污泥）Table 2 Bacterial population in different samples during the arrested decay（copies per ng dired sludge）

隨著反應(yīng)器的運(yùn)行，總細(xì)菌數(shù)量在第16 d出現(xiàn)少量波動(dòng)，隨后緩慢上升，這表明低溫下接種活性污泥中有某些細(xì)菌不適合在15℃的環(huán)境下生長，部分細(xì)菌遭到了淘汰，同時(shí)也有適合該溫度下生長的細(xì)菌迅速生長.

在運(yùn)行初期，由于氨氧化菌對(duì)環(huán)境變化的高度敏感性［18］，AOB種群對(duì)低溫條件下的運(yùn)行環(huán)境需要一段漫長的適應(yīng)過程（反應(yīng)器啟動(dòng)前15 d），AOB和NOB細(xì)菌的數(shù)量均在反應(yīng)運(yùn)行第12 d后出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象.AOB的菌群數(shù)量從1.65×106（第10 d）下降到3.12×104（第12 d），NOB的菌群數(shù)量從2.12×106（第10 d）上升到2.54×106（第12 d），而該天系統(tǒng)的亞硝酸鹽積累率卻依然保持67%，但隨后系統(tǒng)的亞硝酸鹽積累率逐漸下降到56%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AOB、NOB菌群數(shù)量的變化對(duì)亞硝酸鹽的積累率的影響存在滯后性，故當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)AOB菌群數(shù)量降低時(shí)，應(yīng)及時(shí)調(diào)整控制策略，進(jìn)而穩(wěn)定系統(tǒng)的短程硝化效果［6］.

2.3 恢復(fù)階段氯酸鹽對(duì)微生物群落的影響

在實(shí)驗(yàn)恢復(fù)階段，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測SBR反應(yīng)器活性污泥中總細(xì)菌、氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的數(shù)量，監(jiān)測結(jié)果見表3.在停止投加氯酸鈉抑制劑后，AOB的種群數(shù)量持續(xù)上升，達(dá)到9.34×106拷貝數(shù)每ng干污泥，NOB的種群數(shù)量也持續(xù)保持抑制狀態(tài)，沒有明顯的波動(dòng).系統(tǒng)的亞硝酸鹽積累率依然保持在90%以上，并在停止投藥15 d內(nèi)AOB數(shù)量繼續(xù)上升，NOB數(shù)量保持穩(wěn)定的狀態(tài).

表3 恢復(fù)階段污泥樣品中各類細(xì)菌數(shù)量（拷貝數(shù)每ng干污泥）Table 3 Bacterial population in different samples during the recover decay（copies per ng dired sludge）

針對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)AOB和NOB的菌群數(shù)量進(jìn)行分析（表2、表3所示），NOB數(shù)量在氯酸鹽抑制劑作用下持續(xù)下降，在系統(tǒng)達(dá)到短程硝化后，停止投加氯酸鹽，系統(tǒng)內(nèi)NO3－N濃度并沒有明顯的上升，亞硝酸鹽積累也維持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài).說明氯酸鹽抑制劑對(duì)NOB細(xì)菌的抑制在短時(shí)間內(nèi)是“不可恢復(fù)”的，它能夠?qū)е翹OB死亡進(jìn)而遭受淘汰.氯酸鹽導(dǎo)致NOB細(xì)菌凋亡的具體原因至今并未得到證實(shí).HYNES和KNOWLES曾推測［19］，氯酸鹽中真正抑制NOB細(xì)菌的是ClO－3的還原產(chǎn)物ClO－2，亞硝化菌Nitrosococcus europaea純培養(yǎng)物不受氯酸鈉抑制，卻受到亞氯酸鈉嚴(yán)格抑制；如果抑制了NOB的活性，那么在分解前NOB就不會(huì)受到抑制，因此在投藥后1 h內(nèi)能在系統(tǒng)中監(jiān)測到NO3－N濃度（數(shù)據(jù)沒有列出）.說明投藥后1 h內(nèi)NOB的活性依然活躍，存在NO3－N，短程硝化反硝化效果不穩(wěn)定.此外，結(jié)構(gòu)極其相似，可能發(fā)生底物競爭現(xiàn)象［20］.競爭酶的活性位點(diǎn)，使得微生物不能得到有效的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致NOB死亡［21］.

3 結(jié) 論

（1）采用SBR反應(yīng)器，通過向反應(yīng)器投加氯酸鈉抑制劑，投加濃度為3.6 mmol·L－1.系統(tǒng)亞硝酸鹽積累率超過90%.氨氮去除率在95%以上，成功實(shí)現(xiàn)了短程硝化.

（2）利用氯酸鈉抑制劑啟動(dòng)短程硝化系統(tǒng)具有可行性.在抑制階段，AOB數(shù)量持續(xù)上升，NOB數(shù)量受到抑制生長，反應(yīng)器內(nèi)亞硝酸鹽積累率隨著NOB的活性抑制而逐漸提高并趨向于穩(wěn)定，運(yùn)行第28 d時(shí)氨氧化菌含量為1.05×109拷貝數(shù)每ng干污泥，NOB含量下降至3.96×104拷貝數(shù)每ng干污泥，是運(yùn)行初期的1／138，亞硝酸鹽積累度也達(dá)到90%以上.說明了氯酸鈉對(duì)NOB具有選擇抑制性，對(duì)AOB的活性沒有明顯影響，能夠快速促進(jìn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)較高的亞硝酸鹽積累現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)短程硝化.

（3）氯酸鹽抑制劑對(duì)NOB細(xì)菌的抑制在短時(shí)間內(nèi)是“不可恢復(fù)”的.在恢復(fù)階段，AOB數(shù)量持續(xù)上升，停止投藥15 d后達(dá)到1.32×107拷貝數(shù)每ng干污泥，NOB數(shù)量和亞硝酸鹽積累率也持續(xù)穩(wěn)定狀態(tài).短程硝化反應(yīng)啟動(dòng)后，可以停止投加氯酸鈉，改用其他運(yùn)行參數(shù)（如DO、FA、HRT）控制短程硝化.

［1］ VERSTRAETE W，PHILIPS S.Nitrification-denitrification processes and technologies in new contexts［J］.Environ Pollut，1998，102（S1）：717-726.

［2］ 李光偉，劉和，張峰，等.熒光定量PCR監(jiān)測五氯酚對(duì)好氧顆粒污泥和活性污泥中氨氧化細(xì)菌數(shù)量的影響［J］.微生

物學(xué)報(bào)，2007，47（1）：136-140.

LI G W，LIU H，ZHANG F.Real time PCR quantification of ammonia-oxidizing bacteria in aerobic granular sludge and activated sludge influenced by pentachlorophenol［J］.Acta Microbiol Sin，2007，47（1）：136-140.

［3］ LIMPIYAKORN T，SHINOHARA Y，KURISU F，et al.Communities of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge of various sewage treatment plants in Tokyo［J］.FEMS Microbiol Ecol，2005，54（2）：205-217.

［4］ LAYTON A，DIONISI H，KUO H，et al.Emergence of competitive dominant ammonia-oxidizing bacterial populations in a fulscale industrial wastewater treatment plant［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（2）：1105-1108.

［5］ HARMS G，LAYTON A，DIONISI H，et al.Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant［J］.Environ Sci Tech，2003，37（2）：343-351.

［6］ 李磊，張立東，劉靜茹，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)A2／O短程硝化系統(tǒng)內(nèi)氨氧化菌的定量分析［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2012，6（10）：3597-3602.

LI L，ZHANG L D，LIU J R.Real-time PCR quantification of ammonia oxidizing bacteria in short-cut A2／O process treating domestic wastewater［J］.Chin J Environ Engin，2012，6（10）：3597-3602.

［7］ 張斌，孫寶盛，劉慧娜，等.膜生物反應(yīng)器中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的演替與分析［J］.天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，42（1）：65-71. ZHANG B，SUN B S，LIU H N.Analysis and succession of Ammonia-oxidizing bacterial community structure in membrane bioreactor［J］.J Tianjin Univ，2009，42（1）：65-71.

［8］榮宏偉，凌忠勇，彭永臻，等.SBBR工藝中亞硝酸型同步硝化反硝化的過程控制［J］.水處理技術(shù)，2008，34（12）：23-27.

RONG H W，LING Z Y，PENG Y Z.Process control of simultaneous nitrification and denitrification via nitrite in sequencing batch biofilm reactor［J］.Tech Water Treat，2008，34（12）：23-27.

［9］ HAMODA M F，ALATTAR I M S.Effects of high sodium chloride concentrations on activated sludge treatment［J］.Wat Sci Tech，1995，31（9）：61-72.

［10］秦宇，方芳，郭勁松，等.溶解氧對(duì)單級(jí)自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)功能菌數(shù)量的影響［J］.微生物學(xué)報(bào)，2009，49（6）：773-779. QIN Y，F(xiàn)ANG F，GUO J S.Quantification of functional bacteria in one-step completely autotrophic nitrogen removal process influenced by dissolved oxygen［J］.Acta Microbiol Sin，2009，49（6）：773-779.

［11］THOMAS E，F(xiàn)REITAG L C，CHRISTOPHER D C，et al.Influence of inorganic nitrogen management regime on the diversity of nitrite-oxidizing bacteria in agricultural grassland soils［J］.Appl Environ Microbiol，71（12）：8323-8334.

［12］KOWALCHUK G A，STEPHEN J R，DE BOER W，et al.Analyses of ammonia-oxidizing bacteria of the β subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S ribosomal DNA fragments［J］.Appl Environ Microbiol，1997，63：1489-1497.

［13］DIONISI H M，LAYTON A C，HARINS G，et al.Quantification of Nitrosomonas oligotropha-like ammonia-oxidizing bacteria and Nitrospira spp.from full-scale Wastewater Treatment Plants by competitive PCR［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68：245-253.

［14］LEES H，QUASTEL J H.Bacteriostatic effects of potassium chlorate on soil nitrification［J］.Nature，1945，155（3930）：276-278.

［15］LEES H，SIMPSON J R.The biochemistry of the nitrifying organisms.5.Nitrite oxidation by Nitrobacter［J］.Biochem J，1957，65（2）：297.

［16］HYNES R K，KNOWLES R.Inhibition of chemoautotrophic nitrification by sodium chlorate and sodium chlorite：a reexamination［J］.Appl Environ Microbiol，1983，45（4）：1178-1182.

［17］張朝升，張可方，方茜，等.序批式生物膜法對(duì)城市污水的脫氮效果［J］.水處理技術(shù)，2007，33（2）：54-55. ZHANG C S，ZHAN K F，F(xiàn)ANG Q.Nitrogen removal effect of municipal sewage with low carbon content by sequencing batch biofilm reactor and law of carbon conversion［J］.Tech Water Treat，2007，33（2）：54-55.

［18］鄭雅楠，滝川哲夫，郭建華，等.低溫下生活污水短程硝化的實(shí)現(xiàn)及特性［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2009，29（6）：935-940. ZHENG Y N，AKIO Takigawa，GUO J H.Partial nitrification via nitrite at ordinary and low temperatures in an SBR treating domestic wastewater［J］.Chin Environ Sci，2009，29（6）：935-940.

［19］AAKRA A，UTAKER J B，NES I F.RFLP of rRNA genes and sequencing of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region of ammonia-oxidizing bacteria：A phylogenetic approach［J］.Internat J System Bacteriol，1999.49（1）：123-130.

［20］徐光景.基于化學(xué)法控制的亞硝化與厭氧氨氧化的耦合工藝研究［D］.哈爾濱：哈爾濱建筑大學(xué)，2013：42-43. XU G J.Performance of nitritation adjusted by chemical method and the following anammox［D］.Harbin：Harbin University of Civil Engineering and Architecture，2013：42-43.

［21］TURK O，MAVINIE D S.Selective inhibition：a novel concept for removing nitrogen from highly nitrogenous waters［J］.Environ Teeh Lett，1987，8：419-426.

Quantitative PCR quantification of bacteria in low temperature SBR activated sludge influenced by chlorate

ZHANG Chao-sheng1，WANG Jing-yin1，RONG Hong-wei1，DENG Jie1，HUANG Xiao-peng2，JIANG Xiu-xian2，WU Zhi-yan2

（1.Key Laboratory for Water Quality Security and Protection in Pearl River Delta，Ministry of Education and Guangdong Province，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Sewage Purification CO.，LTD Guangzhou 510655，China）

An activated sludge sequencing batch reactor（SBR）was developed to investigate the nitrogen removal from municipal wastewater based on the partial nitrification.SBR added chlorate was applied to inhibit the activity of nitrite-oxidizing bacteria（NOB）in low temperature.The results showed that the－N removal efficiency and the nitrite accumulation rate of effluent were all above 90%.The quantitative PCR was used to analyze the quantification of ammonia oxidizing bacteria（AOB），nitrite-oxidizing bacteria（NOB）and total bacteria in SBR.The results of real-time PCR revealed chlorate has its selective inhibition on NOB，without affecting the growth rate of AOB.It was also found that NOB inhibition caused by chlorate can't recover in a short time.

chlorate；inhibition of nitrite-oxidizing bacteria（NOB）；partial nitrification.

X 703

A

【責(zé)任編輯：周 全】

1671-4229（2015）01-0069-07

2014－09－24；

2014－12－14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51178125，21477027）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2013010013943）；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012B030800005）

張朝升（1953－）男，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：gdzcs＠126.com