郭培國，王直亮，夏巖石，許蘭桂，李榮華，黃紅弟，張 華，鄭巖松

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

高溫脅迫下菜心SSH cDNA文庫的建立

郭培國1，王直亮1，夏巖石1，許蘭桂1，李榮華1，黃紅弟2，張 華2，鄭巖松2

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

為發(fā)現(xiàn)與菜心耐熱性相關(guān)的差異表達(dá)基因，該研究以耐熱性強的“四九19號菜心”和耐熱性弱的“3T6”作實驗材料，采用抑制差減雜交（SSH）技術(shù)，構(gòu)建了一個高溫脅迫下在“四九19號菜心”中特異表達(dá)的SSH cDNA基因文庫.該文庫共有154個contigs，經(jīng)測序和拼接獲得99條unique ESTs.這些EST序列長度在122～819 bp之間，平均344 bp.BLAST分析發(fā)現(xiàn)99條ESTs代表81個基因，其中68個基因有功能注釋、9個無功能注釋和4個未匹配的新基因.這些基因可能與菜心的耐熱性相關(guān).

菜心；耐熱；SSH cDNA文庫；基因

菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis var. utilis Tsen et Lee）又稱菜薹，是華南地區(qū)栽培面積最大、具有優(yōu)勢和標(biāo)志性的蔬菜種類之一［1］，為十字花科蕓薹屬（Brassica）白菜亞種的一個變種，喜冷涼，屬耐寒和半耐寒性蔬菜［2］.但在盛夏秋初，菜心的生長常常遭遇到不同程度的高溫脅迫，嚴(yán)重影響了菜心的正常生長和發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降［3］.因此高溫季節(jié)菜心的生產(chǎn)成為難題，形成供應(yīng)的淡季.認(rèn)識菜心耐熱性的生理特性和耐熱性的分子機理，可為采用適宜的措施提高菜心的耐熱性、輔助選育出耐熱性強的菜心品種提供理論基礎(chǔ).近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)一些菜心的形態(tài)性狀和生理特性與菜心的耐熱性相關(guān)［3－4］，這對認(rèn)識和了解菜心的耐熱性起到積極作用，但未見開展探討與菜心耐熱性相關(guān)基因等從事分子機理研究的報道.

就發(fā)現(xiàn)與某一性狀相關(guān)基因的方法來講，抑制差減雜交（Suppression subtractive hybridization，SSH）被認(rèn)為是一種較為適合的技術(shù)，可在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)現(xiàn)兩材料間差異表達(dá)的基因［5－6］.該技術(shù)利用mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作材料，通過兩次差減雜交消除兩材料共同cDNA、兩次PCR擴增富集低豐度差異表達(dá)的cDNA，從而達(dá)到分離差異表達(dá)基因的cDNA的目的［5，7］.自1996年報道SSH的方法以來，已成功應(yīng)用在多種動植物上，發(fā)現(xiàn)了多個與表型性狀相關(guān)的功能基因，并成功揭示了動植物中一些生命活動的分子機理［6－9］.

本研究選用在耐熱性上具顯著差異的2個菜心品種（系）作材料，提取高溫脅迫處理后的mRNA，以耐熱性強的菜心材料的cDNA作檢測樣品（Tester）、耐熱性弱的菜心材料的cDNA作為參照樣品（Driver），采用SSH方法建立cDNA基因文庫，測定和分析文庫中的cDNA序列從而發(fā)現(xiàn)與菜心耐熱相關(guān)的基因，并從整體上對所發(fā)現(xiàn)耐熱相關(guān)基因進(jìn)行初步的基因功能分析.研究結(jié)果可為菜心耐熱相關(guān)基因的確定、從分子水平上探究菜心耐熱性機理以及功能基因輔助菜心耐熱品種的選育提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的2份菜心材料“四九19號菜心”和“3T6”的種子由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.其中“四九19號菜心”為耐熱性強的菜心品種，“3T6”為耐熱性弱的菜心品系［4］.

1.2 高溫脅迫處理

2份菜心材料的種子播種于盛有培養(yǎng)基質(zhì)分格的育苗盤中（每格的長寬深分別為6 cm×6 cm×7cm），置于人工氣候箱中萌發(fā)和生長.人工氣候箱光溫條件：白天25℃、12 h 400 μmol·m－2·s－1的光照，晚上20℃；人工氣候箱內(nèi)的相對濕度控制在70%～80%.出苗后及時疏苗，保留每格1株，待幼苗長到3葉1心期，選取生長一致的幼苗移栽至直徑為16 cm、高為20 cm的種植盆中，每盆1株.

待菜心長到現(xiàn)蕾初期，將兩菜心材料移至溫度為38℃、光強為400 μmol·m－2·s－1、相對濕度為70%～80%的人工氣候箱中進(jìn)行高溫脅迫處理，脅迫處理6 h后，收獲薹莖上第3片完全展開葉的葉片，置于液氮中速凍，之后保存在－80℃冰箱中備用.

1.3 總RNA和mRNA的提取

選用Invitrogen公司的Trizol試劑（Catalog No：15596－026）及其操作說明提取高溫脅迫后“四九19號菜心”和“3T6”葉片中的總RNA；使用Promega公司的PolyATract?mRNA Isolation system III試劑盒及操作說明書從提取的總RNA中純化出mRNA.利用Thermo Scientific NanoDrop超微量紫外分光光度計檢測提取的總RNA和mRNA的濃度，保存在－80℃冰箱中備用.

1.4 SSH cDNA文庫的構(gòu)建

選用Clontech的PCR-SelectTM cDNA subtraction Kit，以耐熱性強的菜心品種“四九19號菜心”作為測試樣品（Tester），以耐熱性弱的菜心品系“3T6”作為參照樣品（Driver），按照使用說明書的操作步驟開展2個樣品間的抑制差減雜交.其操作流程簡述如下：取Tester和Driver的mRNA各2 μg，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和聚合反應(yīng)生成雙鏈cDNA，使用RsaI核酸內(nèi)切酶切割雙鏈cDNA并利用2個接頭連接切割后的產(chǎn)物，經(jīng)過兩輪雜交以除去共同cDNA片段，再經(jīng)兩輪PCR擴增（其中第2次為巢式PCR）富集出差異性表達(dá)基因片段；巢式PCR的產(chǎn)物與Promega公司的pGEM-T Easy載體連接形成重組載體，用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中；運用Ampicillin培養(yǎng)基除去未轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，采用藍(lán)／白斑篩選方法鑒別出具有重組載體的白色菌落，用牙簽挑取白色菌落并振蕩培養(yǎng)12 h，取部分菌液加入適量甘油貯存于－80℃冰箱備用，獲得SSH cDNA文庫.

1.5 SSH cDNA文庫的cDNA片段大小與DNA序列分析

為檢測SSH cDNA文庫中各個cDNA片段的大小，利用pGEM-T Easy載體的操作說明中提供的T7啟動子檢測引物（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和SP6啟動子檢測引物（5′-TATTTAGGTGACACTATAG-3′）對各個克隆進(jìn)行菌液PCR，使用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小.

將菌落PCR擴增產(chǎn)物為唯一條帶的克隆送至生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序后的序列數(shù)據(jù)應(yīng)用DNAStar 7.0軟件去除接頭序列和載體序列，并進(jìn)行拼接聚類，獲得拼接后unique ESTs序列.利用GenBank（http：／／www.ncbi.nih.gov／genbank）和KEGG（http：／／www.genome.jp／kegg／）對所有ESTs進(jìn)行同源匹配檢索的Blast分析［10－11］.

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA及mRNA的質(zhì)量分析

總RNA的完整性和純度是構(gòu)建SSH文庫的關(guān)鍵步驟之一［10］.本研究提取到的2個菜心材料的總RNA經(jīng)瓊脂糖電泳，可以清楚地觀察到總RNA中3條邊緣清晰無彌散的28S、18S和5S的RNA條帶，且28S RNA條帶亮度明顯高于18S RNA（圖1）；使用紫外分光光度計檢測2樣品總RNA的A260／A280的比值均在2.0左右.表明提取出的高溫脅迫下“四九19號菜心”和“3T6”菜心材料的總RNA未出現(xiàn)降解，RNA的完整性高、質(zhì)量好.

圖1 “四九19號菜心”和“3T6”菜心材料總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Image of agarose gel electrophoresis for the total RNAs of“Sijiu 19 caixin”and“3T6”

在此基礎(chǔ)上，利用提取的總RNA，采用mRNA純化試劑盒純化各材料的mRNA，純化后的mRNA經(jīng)NanoDrop超微量紫外分光光度計分析，其A260／A280比值在2.0左右，表明mRNA純度較好，符合構(gòu)建SSH cDNA基因文庫的要求.

2.2 抑制差減雜交效果分析

抑制差減雜交效果是建立高質(zhì)量SSH cDNA文庫的核心［6］.從圖2的瓊脂糖凝膠電泳圖可見，第一次PCR中未差減樣品cDNA片段擴增產(chǎn)物的大小主要集中在300～700 bp，而差減樣品的擴增產(chǎn)物主要集中在320～600 bp，表明差減過程有效地除去了非差異表達(dá)片段，而富集了低豐度差異表達(dá)的片段.第二次PCR是根據(jù)接頭序列設(shè)計引物進(jìn)行的巢式PCR，差減和未差減樣品擴增產(chǎn)物片段的大小基本一致；因第二次PCR擴增產(chǎn)物不含部分載體序列，與第一次PCR相比其擴增產(chǎn)物大小稍微減少，主要集中在200～480 bp，這與預(yù)期結(jié)果一致；另外，從圖2中還可觀察到未差減樣品擴增產(chǎn)物的熒光強度明顯高于差減樣品，表明未差減樣品擴增產(chǎn)物的量高于未差減樣品，進(jìn)一步說明了差減樣品中主要為差異表達(dá)的片段.為了檢測差減效率，利用差減和未差減樣品的第二次PCR產(chǎn)物作為模板，分析不同PCR循環(huán)次數(shù)下持家基因RPS6（核糖體蛋白S6，引物1：5′-TCTCTCTTGTGGCTGTAGTC-3′，引物2：5′-CCTGACATCATCCTCCTTAA-3′）的擴增產(chǎn)物；電泳檢測結(jié)果表明，差減樣品為模板經(jīng)33次循環(huán)的擴增產(chǎn)物量與未差減樣品為模板經(jīng)23次循環(huán)的擴增產(chǎn)物的量相當(dāng)（圖3）.這一結(jié)果表明SSH方法的差減效果好、差減效率高，同時也表明了本研究開展的抑制差減雜交實驗獲得成功.

圖2 抑制差減雜交的第一次和第二次PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis image of PCR products at the first and second rounds of SSH

圖3 差減效率的PCR評價Fig.3 Evaluation of subtraction efficiency by PCR

2.3 SSH cDNA文庫的建立

將第二次PCR擴增產(chǎn)物與載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鋪平板和過夜培養(yǎng)后，依據(jù)藍(lán)白斑篩選的原理，對在含有氨芐青霉素平板上白色的陽性克隆進(jìn)行篩選、確認(rèn)和編號，共發(fā)現(xiàn)有161個白色克隆.這些克隆經(jīng)菌落PCR擴增后，擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.結(jié)果見圖4，所得克隆擴增產(chǎn)物主要集中在300～900 bp之間.由于Promega T Easy載體空載體中T7引物到SP6引物之間有179 bp，因此插入到載體中的cDNA片段的大小還要扣除179 bp.有少數(shù)克隆無擴增條帶或擴增出多個條帶，無擴增條帶的克隆將再次采用PCR擴增核實，具多個條帶的克隆將再次鋪平板分離和PCR核實.最后，確定出具有1個擴增條帶的克隆154個，這些克隆所攜帶的cDNA信息即為本研究所得的cDNA基因文庫.

2.4 SSH cDNA文庫的測序與分析

選取文庫中154個具有唯一擴增條帶克隆的菌液PCR擴增產(chǎn)物，送樣給生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行DNA序列分析.根據(jù)154個克隆樣本的測序結(jié)果，除去接頭和載體序列，分析發(fā)現(xiàn)154個ESTs中，最短的EST序列長度為122 bp，最長的EST為785 bp，平均325 bp.

進(jìn)一步利用DNAStar軟件對所有EST序列進(jìn)行拼接聚類，共獲得99個unique ESTs.這些EST序列長度在122～819 bp之間，平均344 bp.運用Genbank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genbank／）和KEGG（http：／／www.genome.jp／kegg／）的蕓薹屬植物油菜基因組及EST數(shù)據(jù)庫，對99個EST序列進(jìn)行BLAST相似性比較，發(fā)現(xiàn)只有4個ESTs在數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)類似的序列，它們可能屬于新的基因序列；其余95個ESTs序列與Genbank和KEGG中公布的數(shù)據(jù)序列具有相似性.分析發(fā)現(xiàn)95個 ESTs序列中有18個ESTs是一些全長基因的部分序列可進(jìn)一步拼接，拼接后代表77個基因.這77個基因中有9個無功能注釋，其余68個基因有功能注釋（表1）.有功能注釋的基因主要與光合作用、信號傳導(dǎo)、活性氧清除、細(xì)胞生長與分化、植物抗逆反應(yīng)等相關(guān).這些有功能注釋的68個基因、無功能注釋的9個基因及4個未發(fā)現(xiàn)相似序列的基因可能與菜心的耐熱性相關(guān).

圖4 篩選出白色克隆的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Image of agarose gel electrophoresis for the PCR products of the partially screened white clones

表1 SSH cDNA文庫中unique EST Blast分析結(jié)果Table 1 Result of Blast analysis for unique ESTs at the SSH cDNA library

續(xù)表1

3 討 論

SSH技術(shù)被認(rèn)為是一種能較好發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因的方法［6，8，12］，總RNA質(zhì)量、酶切割、低拷貝cDNA片段的富集、陽性克隆篩選等操作該技術(shù)的關(guān)鍵步驟［6］.從本研究實驗結(jié)果來看，2菜心材料總RNA電泳圖顯示上樣孔干凈、3個RNA（28S、18S和5S）條帶清晰、OD260／280比值在2.0左右，表明總RNA質(zhì)量好.抑制差減雜交和稀有表達(dá)片段的富集效果經(jīng)電泳檢測的結(jié)果顯示，非差異表達(dá)的cDNA片段被有效的除去，低豐度差異表達(dá)的cDNA片段得到富集，表明抑制差減雜交獲得成功.所建立的具有154個陽性克?。ù?9個unique ESTs）的文庫，測序分析表明陽性克隆插入的cDNA片段大小在122～785 bp之間，平均325 bp.因為理論上四堿基核酸識別酶RsaI每256 bp會有1個酶切位點，且RsaI酶切片段一般小于600 bp［13］.因此，文庫中cDNA片段的大小符合RsaI切割片段長度大小的范圍，表明切割效果較好.就文庫的大小和文庫中EST片段長度來講，與他人在其他植物如油菜［14］、甘藍(lán)［15］、辣椒［16］、小麥［6］和角蒿［12］等建立的SSH文庫基本一致.上述表明，本研究成功建立了一個在菜心耐熱材料中差異表達(dá)的SSH cDNA基因文庫，能較好地發(fā)現(xiàn)熱脅迫下耐熱菜心材料中差異表達(dá)基因.

Blast分析99個unique ESTs，發(fā)現(xiàn)4個未匹配、9個無功能注釋和68個有功能注釋的基因.有功能注釋基因中有相當(dāng)部分基因編碼與光合作用相關(guān)的蛋白，如oxygen-evolving enhancer protein、chlorophyll a-b binding protein、photosystem I reaction center subunit和ribulose bisphosphate carboxylase等，這表明高溫脅迫后耐熱性強的“四九19號菜心”光合相關(guān)的基因表達(dá)量高于耐熱性弱的“3T6”，這與Crafts-Brandner和Salvucci［17］研究得出高溫脅迫首先傷害植物光合器官的結(jié)果一致.另外，這些有功能注釋基因的產(chǎn)物還與保護細(xì)胞免受傷害的抗逆反應(yīng)（如HSP90-like protein GRP94、Metallothionein和peroxidase等）、決定細(xì)胞生死的代謝（如ubiquitin conjugating enzyme）、調(diào)控細(xì)胞生長和分化（如Rho GTPase activation protein）及信號傳導(dǎo)（如CIPK1 interacting protein）等有關(guān)，無功能注釋和未匹配的基因可能屬于新的功能基因，需進(jìn)一步研究了解其可能的功能.所有這些基因可能與菜心的耐熱性相關(guān).

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Preliminary study for investigation of heat-tolerant related genes in flowering Chinese cabbage

GUO Pei-guo1，WANG Zhi-liang1，XIA Yan-shi1，XU Lan-gui1，LI Rong-hua1，HUANG Hong-di2，ZHANG Hua2，ZHEN Yan-song2
（1.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Academy of Agricultural Science，Guangzhou 510308，China）

In order to investigate differentially expressed genes related to heat tolerance in flowering Chinese cabbage，two genotypes“Sijiu 19 caixin（heat tolerance）”and“3T6（heat sensitive）”were chosen as plant materials，a cDNA library comprising the cDNA fragments of differentially expressed genes under heat stress in“Sijiu 19 caixin”was constructed by utilizing the technique of suppression subtractive hybridization（SSH）. The library contains 154 contigs which represent 99 unique ESTs through sequencing and assembling.The lengths of the ESTs range from 122 to 819 bp，with an average length of 344 bp.Blast analysis shows the 99 ESTs stand for 81 genes；among them，68 genes were annotated，9 genes were non-annotated，and 4 novel genes did not match any entry in the databases.These genes may be heat-tolerant related genes in flowering Chinese cabbage.

flowering Chinese cabbage；heat tolerance；SSH cDNA library；gene

S 634.5

A

【責(zé)任編輯：周 全】

1671-4229（2015）01-0043-07

2014－11－10；

2014－11－19

廣州市科技計劃資助項目（1212011541，2014J4100123）；廣州市屬高?？萍加媱澷Y助項目（1201420621）

郭培國（1963－）男，教授.E-mail：guopg＠yahoo.com