吳建平，蔣芳，俞力，潘曉暉

(上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海閘北區(qū) 200070)

PRDX 1在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義*

吳建平，蔣芳，俞力，潘曉暉

(上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海閘北區(qū) 200070)

目的:檢測PRDX1蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)，并分析其表達(dá)異常與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性。方法:構(gòu)建含144例食管鱗癌的組織芯片，免疫組化檢測PRDX1蛋白的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其臨床意義及食管癌患者總生存期之間的關(guān)系。利用PRDX1 shRNA敲降PRDX1表達(dá)，MTT法觀察癌細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示PRDX1在食管鱗癌中的表達(dá)率為66．7%(96/ 144)，而癌旁粘膜中呈弱表達(dá)。PRDX1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。單因素生存分析表明PRDX1蛋白陽性表達(dá)患者較陰性患者預(yù)后更差。而PRDX1的下調(diào)表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的增殖。結(jié)論:PRDX1在食管鱗癌的發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用，是食管鱗癌患者治療的潛在靶點(diǎn)之一。

食管鱗癌;PRDX1;生存分析

我國是世界上食道癌死亡率較高的國家之一，隨著對(duì)食道癌研究的深入，食道癌的療效和預(yù)后有一定程度的提高，但依然存在較高的發(fā)病率和死亡率，尤其是晚期食管癌患者，其5年生存率不到5%［1］。PRDX1是一種抗氧化酶，其不但可以對(duì)于H2O2介導(dǎo)信號(hào)起到調(diào)節(jié)以及抗氧化的作用，還能直接或者間接地參與到多種可能與氧化有關(guān)的生理病理過程，發(fā)揮其分子伴侶的功能［2，3］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PRDX1在腫瘤中異常表達(dá)，PRDX1的過度表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，而在食管鱗癌中的研究相對(duì)罕見。本研究以蛋白水平研究為著手，著重研究PRDX1在食管鱗癌中的相關(guān)表達(dá)，并觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞的功能學(xué)影響。

1 資料與方法

1．1 組織標(biāo)本:收集2005年至2014年部分患者的食管鱗癌標(biāo)本，并對(duì)含有食管鱗癌原發(fā)灶或者部分對(duì)應(yīng)癌旁非腫瘤組織進(jìn)行相關(guān)組織芯片的構(gòu)建。共收集患者144例，其中男性90例，女性54例。60歲及60歲以下69例，60歲以上75例，中位年齡59．5歲。患者術(shù)前均未接受過放化療相關(guān)治療。

1．2 免疫組化實(shí)驗(yàn)

1．2．1相關(guān)抗體:兔抗PRDX1(EPR5434)抗體(EPITOMICS公司，稀釋比例為1:100)。免疫組化技術(shù)采用S－P法(試劑盒由上海凱捷公司購入)，PBS作陰性對(duì)照。

1．2．2 判定標(biāo)準(zhǔn):PRDX1定位于細(xì)胞漿，其陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色。根據(jù)二級(jí)積分法的技術(shù)方法，以陽性細(xì)胞所占5個(gè)以上高倍鏡視野比例作為計(jì)數(shù)依據(jù)，共分為四種評(píng)分方式:占5%～25%為1分;占25%～50%為2分;占50%～75%為3分;而對(duì)于占＞75%的計(jì)數(shù)評(píng)分為4分。此外根據(jù)染色強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行分類:其中淡黃色為1分;黃或深黃色為2分;褐或棕褐色為3分。將兩組計(jì)分進(jìn)行乘積，結(jié)果大于1者則為陽性。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng):將人食管癌細(xì)胞株EC109(上海大學(xué)生命科學(xué)院)放置于控溫37℃，在含5%CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液則采用胎牛血清(10%)的DMEM。

1．3．2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:構(gòu)建sh－PRDX1表達(dá)載體，按照相關(guān)說明書(LipofectAmine 2000)進(jìn)行。EC109細(xì)胞株首先接種于六孔板中，并放置24h，以使其在轉(zhuǎn)染時(shí)能夠達(dá)到75%～85%;使用DMEM分別對(duì)質(zhì)粒與LipofectAmine 2000進(jìn)行稀釋，隨后在室溫條件下放置5min，并將兩者進(jìn)行混勻?；靹蚝箪o止放置20min;隨后將混勻物加入到EC109細(xì)胞中。在37℃的溫度下進(jìn)行孵育。孵育6h后，更換完全DMEM培養(yǎng)基并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng);在24h后進(jìn)行消化傳代。其中部分用于相關(guān)蛋白的提取，另外部分則用于相關(guān)細(xì)胞的增殖。

1．3．3 Western印跡雜交:PBS沖洗2次后快速加入蛋白裂解液進(jìn)行冰上裂解，裂解進(jìn)行10min后，將其移入移液管(1．5mL)，在4℃溫度下進(jìn)行超速離心。30min后提取上清液，并使用BCA法進(jìn)行相關(guān)蛋白定量。采用SDS－PAGE膠(10．5%)對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離，將250mA電流進(jìn)行轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(約2h)。使用脫脂奶粉(5%)進(jìn)行封閉1h;TBST稀釋PRDX1一抗(1:1000)，并在4℃溫度下放置過夜;TBST則進(jìn)行3次洗膜，每次約10min;在室溫下使用TBST稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:5000)，放置1h后進(jìn)行洗膜3次，使ECL顯色。

1．3．4 細(xì)胞增殖:EC109細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染，等待24h后，進(jìn)行胰酶消化的計(jì)數(shù)，按照說明書在每孔以1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日取1塊培養(yǎng)板進(jìn)行提取，早每孔加入濃度為5mg/mL的MTT10ul，經(jīng)過4h培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)液，并在每孔加入150ul的DMSO，反復(fù)進(jìn)行振蕩后使用酶標(biāo)儀在570nm處進(jìn)行OD值檢測。分別取6孔數(shù)據(jù)，并進(jìn)行均數(shù)處理。隨后以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸進(jìn)行繪圖。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17．0對(duì)研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其中t檢驗(yàn)用于計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì);采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行技術(shù)資料的統(tǒng)計(jì);生存分析采用Kaplan－Meier和COX多元回歸分析。

2 結(jié)果

2．1 PRDX1的相關(guān)表達(dá):通過免疫組化試驗(yàn)后，其結(jié)果顯示PRDX1染色呈淡黃至棕黃色，分別在食管鱗狀上皮組織呈微弱著色(圖1A，B)，并在腫瘤中呈彌漫、片狀的相關(guān)分布(圖1C－F)，部分腫瘤組織不著色或呈微弱陽性(圖1G，H)PRDX1在食管鱗癌中的表達(dá)率為66．7%(96/144)。

圖1 PRDX1在食管鱗癌中的表達(dá)。A，B:PRDX1在癌旁組織中的陰性染色;C－F:PRDX1在原發(fā)癌中的陽性染色;G，H:PRDX1在原發(fā)癌中的微弱表達(dá);A，C和E:IHC×10倍;B，D和F:IHC×400倍。

圖2 PRDX1表達(dá)和總生存時(shí)間之間的關(guān)系。

圖3 下調(diào)PRDX1對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的改變

2．2 PRDX1與臨床病理:根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析顯示，PRDX1的表達(dá)呈陽性與患者的基本資料(性別、年齡)以及腫瘤的大小、浸潤深度并無顯著的關(guān)聯(lián)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。見表1。

表1 PRDX1與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2．3 生存分析:單因素分析發(fā)現(xiàn)PRDX1陽性患者的生存期為55．1個(gè)月，陰性患者為71．8個(gè)月，χ2=12．911，P=0．047(圖2)。此外，腫瘤大小(≤6cmvs＞6cm: 65．3vs38．1月，P=0．009)，浸潤深度(T1/T2vsT3/T4: 86．7vs43．6月，P＜0．001)，組織分化(高中分化vs低未分化:70．9vs37．8月，P＜0．001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無:，45．7vs84．1月，P＜0．001)和TNM分期(Ⅰ/ⅡvsⅢ/Ⅳ:89．5vs35．1月，P＜0．001)也與患者的相關(guān)預(yù)后相關(guān)。若將上述因素共同納入Cox進(jìn)行多元回歸分析，其結(jié)果顯示組織分化和TNM分期是能夠判斷食管鱗癌患者其預(yù)后程度的獨(dú)立因素。詳見表2。

2．4 PRDX1下降表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響:敲降PRDX1后24和72h測EC109的增殖情況，我們發(fā)現(xiàn)PRDX1的下降表達(dá)能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖(圖3)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及治療方式的演進(jìn)，食管癌患者的治療效果和生活質(zhì)量有了顯著提升。然而食管癌惡性程度較高，起病迅速，病程進(jìn)展較快，食管癌患者的5年生存率未見顯著提高。因此，深入研究食管癌的發(fā)病機(jī)理，加快食管癌基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究，有助于提高食管癌治療療效和改善食管癌患者預(yù)后。近年來，較多研究顯示氧化損傷和能量代謝異常等促進(jìn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。其中PRDX1作為一種抗氧化酶，直接或間接地參與體內(nèi)多種與氧化相關(guān)的生理病理過程，包括參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而目前關(guān)于PRDX1的研究存在爭議，大部分研究發(fā)現(xiàn)其在人實(shí)體瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、膽管癌、舌鱗癌、腸癌和肺癌等［4～6］，但也有研究顯示在部分實(shí)體瘤中PRDX1表達(dá)缺失，如食管癌等。為了進(jìn)一步明確PRDX1在食管癌中的表達(dá)譜系，我們進(jìn)行了本次研究。

Hoshino等檢測了114例食管鱗癌中PRDX1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRDX1在20%的標(biāo)本中不表達(dá)或弱表達(dá)，50%中度表達(dá)，36%呈高表達(dá)，且PRDX1表達(dá)與食管癌惡性生物學(xué)行為如T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期呈負(fù)相關(guān)，低表達(dá)PRDX1患者預(yù)后要劣于高表達(dá)PRDX1患者，進(jìn)而提出PRDX1具有抑癌基因功能［7］。與之相反，我們的結(jié)果顯示正常組織中PRDX1呈微弱表達(dá)，而食管鱗癌組織中PRDX1蛋白表達(dá)顯著升高，且見于66．7%的食管癌患者。而在進(jìn)一步相關(guān)研究中，PRDX1的過度表達(dá)往往與食管癌的惡性生物學(xué)行為具有極為密切的關(guān)聯(lián)。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的PRDX1的表達(dá)率高達(dá)74．0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌中的52．1%。而隨著疾病的進(jìn)展，PRDX1表達(dá)率也隨之進(jìn)展升高，在Ⅲ和Ⅳ期的患者中PRDX1表達(dá)率則高達(dá)75．9%，遠(yuǎn)高于I和Ⅱ期患者的54．1%。該結(jié)果與乳腺癌和舌鱗癌中的研究較為一致，腫瘤中PRDX1呈高表達(dá)狀態(tài)，且其高表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展相關(guān)［4，5］。

Yanagawa等研究顯示PRDX1過表達(dá)的鱗癌患者更加易于復(fù)發(fā)［5］。而在本研究中，單因素生存分析結(jié)果顯示:PRDX1過表達(dá)食管癌患者的總生存期低于PRDX1低表達(dá)的患者，但多因素回歸分析未顯示PRDX1與TNM分期和組織分化一樣是判斷食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。既往研究顯示，患者的機(jī)體狀態(tài)、手術(shù)因素、病理因素和遺傳學(xué)因素等都會(huì)影響食管癌患者的預(yù)后，因而，還需要大樣本前瞻性工作加以驗(yàn)證PRDX1能否應(yīng)用于臨床，并結(jié)合其他因素加以分析。

進(jìn)而我們研究了PRDX1對(duì)于食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。PRDX1－shRNA敲降PRDX1后，我食管癌細(xì)胞EC109的增殖能力明顯下降，提示了我們PRDX1可能參與了的食管癌細(xì)胞的增殖機(jī)制。這與Riddell等在前列腺癌中的相關(guān)研究非常類似，其下調(diào)了PRDX1的表達(dá)通過抑制腫瘤血管形成和VEGF的表達(dá)進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。上述數(shù)據(jù)表明PRDX1參與了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展，但PRDX1能否作為治療的靶點(diǎn)還有待于深入研究。

表2 影響食管鱗癌預(yù)后的多因素分析

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，etal．Global cancer statistics［J］．CA Cancer Clin，2011，61(2):69～90．

［2］Rhee SG，Kang SW，Chang TS，et al．Peroxiredoxin，a novel family of peroxidases［J］．IUBMB Life，2001，52(1～2): 35～41．

［3］Hofmann B，Hecht HJ，F(xiàn)lohe L．Peroxiredoxins［J］．Biol Chem，2002，383(3～4):347～364．

［4］Cha MK，Suh KH，Kim IH．Overexpression of peroxiredoxin Iand thioredoxin1 in human breast carcinoma［J］．Exp Clin Cancer Res，2009，28:93．

［5］Yanagawa T，Omura K，Harada H，et al．Peroxiredoxin I expression in tongue squamous cell carcinomas as involved in tumor recurrence［J］．Int Oral Maxillofac Surg，2005，34 (8):915～920．

［6］Yonglitthipagon P，Pairojkul C，ChamgramoL Y，et al．Prognostic significance of peroxiredoxin 1 and ezrin－radixinmoesin－binding phosphoprotein 50 in cholangiocarcinoma［J］．Hum Pathol，2012，43(10):1719～1730．

［7］Hoshino I，Matsubara H，Akutsu Y，et al．Tumor suppressor PRDX1 is a prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma patients［J］．Oncol Rep，2007，18(4):867～871．

Expression of PRDX1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and the Significance

WU Jianping，JIANG Fang，YU Li，et al
(The Central Hospital of Zhabei District，Shanghai Zhabei District 200070，China)

Objective:To detect PRDX1 expression and determine the clinical significance in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)．Method:Tissue microarray blocks containing tumor specimens obtained from 144 patientswith ESCC were constructed．Expression of PRDX1 in human ESCC specimenswas analyzed by using immunohistochemistry．cells were transfected with sh－PRDX1 and cell proliferation was analyzed by MTT assay．Result:IHC results showed that expression of PRDX1 was observed in 96 cases (66．7%)of 144 primary tumors．PRDX1 expression was significantly associated with tumor invasion，lymph nodemetastasis，tumor progression and poor differentiation．PRDX1 expression significantly correlated with poor outcome of patientswith ESCC in univariate analysis．Knockdown PRDX1 leaded to the inhibition of cell growth．Conclusion:PRDX1 has played an important role in the process of esophageal squamous cell carcinomas，and itwill be the one of the potential targets for treatment of esophageal squamous carcinoma．

ESCC;PRDX1;Survival analysis

B

10．3969/j．issn．1006－6233．2015．08．013

上海市衛(wèi)生局科研課題，(編號(hào):20114628)

1006－6233(2015)08－1408－04