李 妍，秦 莉，李晶明

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院眼科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，陜西 西安 710061）

姜黃素治療大鼠角膜堿燒傷的實(shí)驗(yàn)研究

李 妍1，2，秦 莉2，李晶明2

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院眼科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，陜西 西安 710061）

目的 觀察姜黃素對(duì)大鼠角膜堿燒傷新生血管（CNV）的抑制作用和對(duì)CD11b及角膜上皮凋亡細(xì)胞表達(dá)的影響，初步探討其治療角膜堿燒傷的作用機(jī)制。方法 選用雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組（每組6只）：A組為空白組，B組為模型組，C組為姜黃素組，D組為二甲基亞砜（DMSO）組。除空白組外，采用氫氧化鈉眼內(nèi)燒傷造模，并予相應(yīng)干預(yù)，第3、7、10、14天裂隙燈下觀察角膜CNV形態(tài)并眼前節(jié)照相記錄CNV長(zhǎng)度，計(jì)算CNV面積，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；通過H-E染色法觀察角膜病理形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法觀察CD11b表達(dá)；TUNEL染色法檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞凋亡表達(dá)。結(jié)果 裂隙燈下觀察B組和D組CNV生長(zhǎng)旺盛，管腔粗大，C組CNV稀疏管腔細(xì)?。? d時(shí)三組CNV面積分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，7、10、14 d時(shí)CNV面積比較C組CNV面積顯著降低(P＜0.05)；H-E染色B組和D組角膜基質(zhì)層內(nèi)大量的CNV管腔和血細(xì)胞，C組基質(zhì)層偶見CNV，管腔細(xì)??；A組CD11b、角膜上皮凋亡細(xì)胞在角膜僅少量表達(dá)，B組和D組CD11b在基質(zhì)層新生血管內(nèi)壁上高表達(dá)，角膜上皮層凋亡細(xì)胞高表達(dá)，C組CD11b低表達(dá)，角膜上皮層凋亡細(xì)胞低表達(dá)。結(jié)論 姜黃素能有效的抑制大鼠角膜堿燒傷CNV治療角膜堿燒傷，通過下調(diào)CD11b抗炎和下調(diào)角膜上皮凋亡細(xì)胞抗凋亡發(fā)揮作用。

姜黃素；角膜堿燒傷；新生血管；CD11b；角膜上皮層細(xì)胞；凋亡

角膜堿燒傷是眼外傷中一種嚴(yán)重的致盲性眼病。在我國(guó)，嚴(yán)重的角膜化學(xué)傷引起的角膜新生血管（CNV）占整個(gè)角膜疾病的10%。堿性化學(xué)物質(zhì)發(fā)生皂化作用很快穿透眼組織，引起角膜新生血管、潰瘍等導(dǎo)致視力喪失。目前治療角膜堿燒傷的方法多種多樣，但仍缺少一種有效、經(jīng)濟(jì)、安全的臨床藥物。姜黃素是我國(guó)的一種傳統(tǒng)草藥提取物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[1]以及誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡[2]。安全性高毒性小，易溶于乙醇、二甲基亞砜（DMSO），微溶于水，近年來在眼科領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，研究表明姜黃素通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)抑制新生血管[3]、通過抗增殖、抗纖維化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡治療青光眼濾過瘢痕和翼狀胬肉等[4]。2008年蘇凡凡[5]研究姜黃素能抑制大鼠角膜堿燒傷CNV，但未探討作用機(jī)制，同年胡靜[6]探討姜黃素治療大鼠角膜堿燒傷是通過調(diào)控角膜超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）抗氧化作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，近年來有關(guān)姜黃素治療角膜堿燒傷的作用機(jī)制研究甚少，本實(shí)驗(yàn)在這些研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察姜黃素抑制大鼠角膜堿燒傷的CVN，并通過檢測(cè)姜黃素對(duì)炎性指標(biāo)CD11b表達(dá)和角膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器和試劑

裂隙燈顯微鏡，眼前段照相系統(tǒng)（日本CANON公司），石蠟組織切片機(jī)（德國(guó)LEIKA公司）；兔抗大鼠CD11b多克隆抗體 （Abcom公司），SP免疫試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），TUNEL試劑盒（Roche公司），Whatman 3#濾紙（美國(guó)SIGMA公司），98.5%姜黃素原料藥粉劑（50g/瓶，sigma公司），DMSO（上海榕柏生物技術(shù)有限公司），氫氧化鈉、蘇木素溶液和伊紅溶液（西安生物化學(xué)試劑廠），TritonX-100和Tween-20(上海艾研生物科技有限公司)。

1.2 姜黃素的配制[7]

147 mg的姜黃素溶于10 mL的DMSO溶液中，濃度為40 mmol/L，按每管25 μL分裝，避光保存于-20℃冰箱中，結(jié)膜下注射前以生理鹽水按1∶1000稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.30.1%DMSO試劑配制

0.1 mL的DMSO溶于100 mL的生理鹽水中，4℃保存。

2 方法

2.1 造模與分組

清潔級(jí)健康無眼疾的成年雄性SD大鼠24只，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量（230±60）g，合格證號(hào):0034325，許可證號(hào):SCXK-(陜)2007-001，采用隨機(jī)數(shù)字分組法分為4組 （每組6只）:A組為空白組，不給予任何處理；B組為模型組；C組為姜黃素組；D組為DMSO組，每組右眼為實(shí)驗(yàn)眼。B組、C組和D組動(dòng)物分別用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，以直徑3 mm的圓形濾紙片浸入1 mol/L NaOH溶液中20 s，置于干燥濾紙上吸除多余的堿液，均勻地貼于大鼠右眼角膜中央40 s，取下濾紙后生理鹽水迅速?zèng)_洗1 min制造大鼠角膜堿燒傷模型[8]。

2.2 干預(yù)

B組結(jié)膜下注射生理鹽水0.1 mL，C組結(jié)膜下注射濃度為40 μM姜黃素溶液0.1 mL，D組結(jié)膜下注射0.1%DMSO 0.1 mL，各組結(jié)膜下隔天注射1次，共注射7次。

2.3 觀測(cè)指標(biāo)

2.3.1 CNV面積計(jì)算 分別在第3、7、10、14天裂隙燈下觀察大鼠角膜CNV形態(tài)改變，同時(shí)進(jìn)行眼前段照相，記錄CNV長(zhǎng)度（以連續(xù)且彎曲度小，并與角膜緣切線垂直的新生血管長(zhǎng)度為準(zhǔn)）計(jì)算CNV面積。計(jì)算CNV面積公式[9]:

S為CNV生長(zhǎng)面積，C為CNV網(wǎng)的跨圓周鐘點(diǎn)數(shù)，r為角膜半徑，l為新生血管長(zhǎng)度。

2.3.2 CD11b表達(dá)及上皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 第14天頸椎脫臼處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，迅速摘取完整右眼球，顯微角膜剪眼球后壁剪開約1 mm直徑的小口，1 mL的注射器針頭從小口刺入至角膜內(nèi)皮層后，置15%中性甲醛溶液中固定48 h。眼球依次采用濃度梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，采取矢狀面切片，切片厚度4 μm。

（1）H-E染色觀察角膜病理形態(tài)學(xué)改變:石蠟切片常規(guī)蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察角膜形態(tài)學(xué)變化。（2）免疫組化（S-P法）觀檢測(cè)CD11b:石蠟切片常規(guī)脫蠟完成水化，采用過氧化氫室溫孵育，抗原修復(fù)，山羊血清封閉切片，滴加1∶10稀釋的兔抗大鼠CD11b一抗過夜后，滴加生物素標(biāo)記的二抗孵育，再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，用DBA顯色試劑盒顯色蘇木精核復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，乙醇依次脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，以PBS代替一抗作空白對(duì)照，觀察CD11b表達(dá)。（3）TUNEL染色檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞凋亡:石蠟切片常規(guī)脫蠟完成水化，PBS洗滌3次，置于0.1%冰檸檬酸鈉溶液冰上通透5 min，用PBS液沖洗2次，組化筆標(biāo)記組織后加入20 μL的TUNEL混懸液，避光孵育1 h，沖洗封片。（4）數(shù)據(jù)平均光密度計(jì)算:每組各取6張切片，選取3個(gè)背景良好的視野區(qū)照相，CD11b染色結(jié)果采用Image ProPlus6彩色圖像分析軟件，分析每張圖片中角膜組織區(qū)域的積分光密度（IOD）和面積（area），計(jì)算平均光密度值（IOD/area）。（5）凋亡率的計(jì)算:隨機(jī)選取TUNEL染色角膜上皮細(xì)胞中3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算角膜上皮凋亡細(xì)胞和和角膜上皮細(xì)胞總數(shù)，角膜上皮細(xì)胞凋亡率=角膜上皮凋亡細(xì)胞數(shù)/角膜上皮細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CNV形態(tài)觀察和CNV面積比較

如圖1所示:裂隙燈下觀察空白組，角膜透亮，無CNV；第3 d時(shí)各組均睫狀充血，角膜堿燒傷區(qū)水腫明顯，堿燒傷斑明顯，角鞏膜緣處新生血管芽呈刷狀長(zhǎng)出，三組CNV形態(tài)表現(xiàn)基本相同；7 d時(shí)模型組和DMSO組角膜新生血管生長(zhǎng)旺盛致密，頂端分叉，接近堿燒傷區(qū)，堿燒傷區(qū)水腫明顯；姜黃素組CNV頂端分叉稀疏，血管管腔細(xì)，未達(dá)到堿燒傷區(qū)，部分鐘點(diǎn)位無新生血管，堿燒傷區(qū)水腫程度輕。10 d時(shí)模型組和DMSO組CNV致密呈網(wǎng)狀，血管筆直，管腔粗大，范圍廣泛，頂端到達(dá)角膜中央交織，堿燒傷區(qū)灰白色水腫；黃素組CNV稀疏，開始退化，血管影可見，管腔細(xì)，堿燒傷區(qū)清亮。14 d時(shí)模型組和DMSO組CNV仍粗大致密，達(dá)到高峰開始消退；姜黃素組CNV大部分消退萎縮至堿燒傷區(qū)外，角膜大部分鐘點(diǎn)位無CNV，血管管腔狹小，角膜上皮光滑。

如表1所示，角膜堿燒傷3 d時(shí)CNV面積比較組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。7 d、10 d和14 d時(shí)CNV面積比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。C組CNV面積顯著降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。

3.2 14 d各組病理形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，14 d時(shí)A組H-E染色角膜5層結(jié)構(gòu)清晰、完整，基質(zhì)層無水腫增厚，見排列整齊的膠原纖維，未見新生血管腔；B組和D組角膜組織水腫增厚，基質(zhì)層纖維排列紊亂，可見大量的CNV管腔、血細(xì)胞和炎性細(xì)胞，管腔粗大；C組角膜上皮趨于光滑平整，基質(zhì)層水腫減退，厚度基本接近A組，基質(zhì)層CNV消退減少，管腔狹小。

圖1 角膜新生血管7、10、14 d形態(tài)觀察

表1 大鼠角膜堿燒傷新生血管面積（±s，n=6，mm2）

表1 大鼠角膜堿燒傷新生血管面積（±s，n=6，mm2）

注:與模型組（B組）和DMSO組（D組）比較#P＜0.05；模型組（B組）和DMSO組（D組）比較P＞0.05。

組別B組C組D組F P 3 d 8.25±1.33 8.00±1.09 8.05±1.26 0.07 0.93 7 d 19.59±1.69 14.22±1.59#19.40±2.29 15.73＜0.05 10 d 23.14±1.77 15.54±3.39#22.27±2.34 8.86＜0.05 14 d 21.31±2.64 12.25±4.03#20.21±2.02 21.67＜0.05

圖2 大鼠角膜堿燒傷光鏡圖（HE染色×100）

3.3 各組CD11b表達(dá)的比較

如圖3所示，14 d時(shí)A組大鼠角膜上皮層和內(nèi)皮層CD11b微量表達(dá)，B組和D組CD11b棕黃色顆粒增多，染色顆粒顏色增強(qiáng)，主要定位于角膜上皮層、基質(zhì)層的新生血管內(nèi)皮層，C組CD11b染色接近A組，棕黃色顆粒減少，染色顆粒顏色減弱，基質(zhì)層CNV內(nèi)壁染色顆粒減少。

圖3 大鼠角膜堿燒傷基質(zhì)層CD11b免疫組化顯微圖（×50）

CD11b表達(dá)比較，B組CD11表達(dá)顯著高于A組（P＜0.05），C組CD11b表達(dá)顯著低于B組和D組（P＜0.05），而D組與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3.4 各組角膜上皮細(xì)胞凋亡的比較

14 d時(shí)A組見角膜上皮層下方細(xì)胞核黃棕色著染的凋亡細(xì)胞，B組角膜上皮層細(xì)胞核胞漿均黃棕色著染，出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，C組角膜上皮層下方可見凋亡細(xì)胞，上皮層細(xì)胞核仍藍(lán)染，和A組相似，D組角膜上皮細(xì)胞核細(xì)胞漿均黃棕色著染，出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，和B組相似。見圖4。

圖4 大鼠角膜堿燒傷角膜上皮細(xì)胞凋亡顯微圖（TUNEL染色×50）

角膜上皮凋亡細(xì)胞表達(dá)比較，B組角膜上皮凋亡細(xì)胞表達(dá)顯著高于A組 （P＜0.05），C組角膜上皮凋亡細(xì)胞表達(dá)顯著低于B組（P＜0.05），而D組與B組比較，角膜上皮凋亡細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡細(xì)胞凋亡率 （±s）

表2 各組大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡細(xì)胞凋亡率 （±s）

注:與A組比較*P＜0.05；C組和B組、D組比較#P＜0.05，D組和B組比較P＞0.05。

組別A組B組C組D組 F P n 6 6 6 6平均光密度值（IOD/area）CD11b 0.007 6±0.000 6 0.031 9±0.002 5* 0.016 4±0.001 0#0.032 5±0.002 4 164.365 0＜0.05凋亡率（%）TUNEL 9.01±2.17 72.31±13.25* 12.34±3.10#75.72±11.14 58.40＜0.05

4 討論

角膜過多的CNV破壞了角膜的微環(huán)境和透明性，成為臨床上致盲的主要原因之一。CNV的形成機(jī)制復(fù)雜，VEGF學(xué)說是CNV目前公認(rèn)的主要機(jī)制之一，戴鵬飛等[10]實(shí)驗(yàn)證明大鼠角膜堿燒傷后VEGF的表達(dá)和CNV的變化成正相關(guān)，林小俊[3]實(shí)驗(yàn)表明姜黃素能顯著減少VEGF的表達(dá)抑制CNV。目前臨床上尚缺乏理想的抑制CNV的藥物，糖皮質(zhì)激素能抗炎抑制CNV，但眼部使用副作用大，不能在眼表長(zhǎng)期安全使用。美國(guó)上市的抗VEGF藥物貝伐單抗（Avstain）能抑制CNV，但其價(jià)格昂貴，主要用于腫瘤內(nèi)科，眼科使用受限。有研究表明姜黃素整體抗CNV的能力并不輸于Avastin[11]。本實(shí)驗(yàn)中14 d時(shí)C組CNV比其它組在數(shù)量、長(zhǎng)度和范圍上減少，CNV面積減少，H-E染色觀察C組角膜上皮光滑，基質(zhì)層水腫輕，CNV數(shù)量少，證明姜黃素能有效地抑制大鼠角膜堿燒傷CNV。

角膜堿燒傷刺激大量的多形核白細(xì)胞（PMN）和炎性介質(zhì)釋放，發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞黏附因子CD11b在正常情況下低表達(dá)，但在炎癥急性期大量表達(dá)，對(duì)白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的遷移、聚集和趨化起著重要的作用，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志。正常的角膜組織中不同程度的存在著各種黏附分子，但均少量表達(dá)。整合素家族是黏附家族的重要成員之一，參與調(diào)控炎癥期PMN的吸附、滲出和遷移[12-13]，CD11b/CD18是巨噬細(xì)胞分化抗原 1（Mac-1）——作為整合素家族中重要的膜蛋白，對(duì)PMN的調(diào)控作用顯著，CD11b也就成為抑制機(jī)體炎癥時(shí)加以阻斷的重要靶點(diǎn)，使得多種因素可調(diào)控CD11b的表達(dá)[14]。近年有研究表明CD11b的高表達(dá)是重癥肺炎患兒中性粒細(xì)胞的判斷依據(jù)[15]、干預(yù)CD11b的表達(dá)可以減輕膿毒癥大鼠的炎性反應(yīng)等[16]。角膜堿燒傷早期PMN和淋巴細(xì)胞侵入病變區(qū)域，2周至3周時(shí)大量的PMN浸潤(rùn)，外界刺激改變了CD11b的構(gòu)象，激活P53-MARK信號(hào)通路介導(dǎo)PMN等迅速到達(dá)感染部位發(fā)揮效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中A組CD11b僅微量表達(dá)，在堿燒傷炎癥期CD11b在基質(zhì)層和基質(zhì)層新生血管內(nèi)皮上高表達(dá)，證實(shí)了CD11b代表了炎癥細(xì)胞，C組下調(diào)了CD11b的表達(dá)，為姜黃素通過抗炎作用機(jī)制治療角膜堿燒傷奠定了理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡是生理性的，亦是病理性的。正常的角膜上皮細(xì)胞僅有少量的細(xì)胞凋亡維持生理代謝，角膜堿燒傷時(shí)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是同時(shí)存在的。角膜堿燒傷時(shí)眼表的炎癥因子和促凋亡因子激活凋亡通路，同時(shí)產(chǎn)生大量的PMN和炎性細(xì)胞，過多的吞噬角膜壞死組織發(fā)生呼吸爆破，生成大量的活性氧簇 （ROS），ROS可以通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。但也有研究表明姜黃素存在雙向濃度調(diào)控，高濃度的姜黃素能顯著增加細(xì)胞中的活性氧，激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。因此，姜黃素給藥濃度的摸索是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)中TUNEL染色角膜上皮細(xì)胞核染黃褐色顆粒的為陽(yáng)性表達(dá)，B組角膜上皮細(xì)胞胞核和胞漿均黃褐色深染，C組姜黃素干預(yù)后角膜上皮層凋亡細(xì)胞減少，結(jié)果為姜黃素通過抗凋亡作用機(jī)制治療角膜堿燒傷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

姜黃素作為一種中藥，具有多途徑治療疾病的特點(diǎn)，能有效地抑制角膜堿燒傷CNV，通過下調(diào)CD11b表達(dá)抗炎、抗角膜上皮細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療角膜堿燒傷作用，為臨床治療角膜堿燒傷提供新的理論依據(jù)，但其調(diào)控通路和作用機(jī)制仍不明確，需要從多途徑、多層面的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步探討。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study of Curcumin in Treating Corneal Alkaline Burn of Rats

Yan Li1,2,Li Qin2,Jing-Ming Li2
(1.Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Xi'an,Shanxi 710004,China;
2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an,Shanxi 710061,China)

Objective To study the inhibition of curcumin on corneal neovascularization(CNV)in the corneal alkaline burned rats,and the effect on CD11b and corneal epithelium apoptosis.Then investigate its mechanism on treatment of corneal alkaline burn.Methods 24 male SD rats were randomly divided into 4 groups(6 rats in each group):Group A was the blank control group,Group B was the model group,Group C was the curcumin group,and Group D was the DMSO group.Except for the blank group,the other groups were modeled by sodium hydroxide to induce the burn in eyes and with the corresponding intervention.On the 3th day,7th day,10th day and 14th day,CNV was observed and taken photos with slit-lamp microscope.The CNV area was calculated accordingly,and all data were analyzed statistically.The pathological change was observed by H-E staining; the expression of CD11b in corneal was detected with immunohistochemical method;the corneal epithelial cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Results The CNV of Group B and Group D was vigorous,its lumen was wider,CNV of Group C was scattered and small;The CNV area of three groups at 3th day was not statistically different (P＞0.05);The CNV area of Group C was decreased significantly at 7th, 10th,14th day (P＜0.05).After HE staining,there were amount of lumen of CNV and haemocytes in the stromal layer,CNV of group C was few and with small lumen.CD11b and TUNEL cells of Group A were lowly expressed in epithelium of cornea;CD11b of Group B and D in the CNV wall and corneal epithelium apoptosis were highly expressed,while that in Group C were with low expression.In B group,they were obviously expressed and had statistically significant conversely.Compared with B group,they were lower in C group.The expression level between D group and B group was no significant different.Conclusion Curcumin could inhibit CNV effectively in the corneal alkaline burned rats to antiinflammatory and anti-apoptosis effects through down regulating CD11b and corneal epithelium apoptosis.

curcumin;corneal alkaline burn;corneal neovascularization;CD11b;corneal epithelium;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.006

2015-01-30

陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011k1402-04）。

李 妍，女，碩士，主治醫(yī)生，研究方向:眼表疾病，白內(nèi)障。