蔣 聰 張 松 陳 龍 吳小麗

(重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶 401123)

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制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡放大倍數(shù)及示值誤差方法

蔣 聰 張 松 陳 龍 吳小麗

(重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶 401123)

主要介紹了制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡的放大倍數(shù)及示值誤差的方法。通過對(duì)雙光子熒光顯微鏡的構(gòu)成及其工作原理的分析，在用傳統(tǒng)方法不能實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)的放大倍數(shù)及示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn)的情況下，研發(fā)制作了一套標(biāo)準(zhǔn)花粉樣片，用樣片作為標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)雙光子熒光顯微鏡的放大倍數(shù)及示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn)，并通過不確定度分析對(duì)該方法的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。

花粉樣片；雙光子熒光顯微鏡；光學(xué)放大倍數(shù)；示值誤差；測(cè)量不確定度

0 引言

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展，雙光子熒光顯微鏡是為了觀察和研究活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生命過程而研發(fā)的一種新型顯微鏡，它結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測(cè)效率。為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中重要的研究手段。

由于它的特殊工作原理，其放大倍數(shù)和示值誤差的校準(zhǔn)無法采用普通顯微鏡的校準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)，對(duì)普通顯微鏡我們通過測(cè)微尺進(jìn)行校準(zhǔn)，而現(xiàn)在所有的測(cè)微尺都無法在雙光子熒光顯微鏡的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中掃描成像。為此，必須選擇一種能夠在雙光子熒光顯微鏡下掃描成像的標(biāo)準(zhǔn)器具。目前世界上只有個(gè)別發(fā)達(dá)國(guó)家制作有標(biāo)準(zhǔn)熒光球作為校準(zhǔn)這種顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)器，其價(jià)值昂貴，且準(zhǔn)確度極高，有的只有幾納米，國(guó)內(nèi)量值溯源也有一定困難。我們通過分析比較，嘗試了多種方法，最后采用了生物顯微鏡常用的測(cè)試材料花粉顆粒，制作成花粉樣片來進(jìn)行校準(zhǔn)。

1 花粉樣片的制作與標(biāo)定

首先采用做分析實(shí)驗(yàn)的花粉顆粒在玻璃上制成樣片，并對(duì)其進(jìn)行分區(qū)，然后在萬能工具顯微鏡上觀察，以形狀較好的位置容易區(qū)分的花粉顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)顆粒進(jìn)行標(biāo)定，給出標(biāo)準(zhǔn)顆粒的直徑值。

為了對(duì)顯微鏡較為全面的量程范圍進(jìn)行校準(zhǔn)，需要選擇幾種直徑不同的花粉進(jìn)行標(biāo)定，通過萬能工具顯微鏡，很容易發(fā)現(xiàn)，不同的花粉顆粒其顏色和尺寸差別是很大的。選取四類不同花粉顆粒，直徑從0.01～0.12mm。由于自然花粉不一定都呈現(xiàn)完美的圓形，必須采用單一顆粒在固定方向上標(biāo)定其直徑，以避免校準(zhǔn)環(huán)節(jié)引入花粉形狀誤差。

花粉樣片圖見圖1。

圖1 花粉樣片圖

2 校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)和示值誤差

對(duì)已交付運(yùn)行中的一套北京博銳雙光子科技有限公司制造的BR-SUP01型“超高速雙光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)系統(tǒng)”進(jìn)行了校準(zhǔn)測(cè)試，方法如下：將制作的花粉樣片在萬能工具顯微鏡下標(biāo)定后，放于雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上，依次將標(biāo)定了直徑的一組花粉顆粒用雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，將測(cè)試值與萬能工具顯微鏡上的標(biāo)定值進(jìn)行比較，得到放大倍數(shù)和示值誤差。

相對(duì)放大倍數(shù)誤差計(jì)算公式：

Δβ=[(Li-L0)/L0]100%

(1)

式中：Δβ為相對(duì)放大倍數(shù)誤差；L0為萬能工具顯微鏡標(biāo)定的花粉顆粒直徑；Li為雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)得的花粉顆粒直徑。

示值誤差計(jì)算公式：

ΔL=(Li-L0)

(2)

以下給出一組具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析演算過程：

系統(tǒng)測(cè)試狀況：測(cè)量物鏡為40X，掃描與圖像采集速度為40fps。測(cè)量10個(gè)花粉顆粒，其測(cè)試數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表1所示。

表1 花粉顆粒測(cè)試數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果 (單位：μm)

以該組數(shù)據(jù)的最大相對(duì)差值計(jì)算雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)相對(duì)誤差：

Δβ=[(Li-L0)/L0]100%=0.048×100%=4.8%

以該組數(shù)據(jù)的最大相對(duì)差值計(jì)算雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的示值誤差：

（1）組建企業(yè)集團(tuán)財(cái)務(wù)公司。組建財(cái)務(wù)公司能夠極大地降低企業(yè)集團(tuán)在金融市場(chǎng)中的交易成本，提高利潤(rùn)與企業(yè)綜合競(jìng)爭(zhēng)力。具體而言有以下優(yōu)勢(shì)：財(cái)務(wù)公司擴(kuò)張性強(qiáng)，能夠吸引外部有益投資；能夠從側(cè)面拓展企業(yè)業(yè)務(wù)，促進(jìn)企業(yè)集團(tuán)綜合競(jìng)爭(zhēng)力的提高；具有較為直接的融資能力，切實(shí)滿足企業(yè)集團(tuán)加強(qiáng)內(nèi)部資金管理以及融資的需求；能夠?yàn)槠髽I(yè)集團(tuán)與金融機(jī)構(gòu)的結(jié)算方式提高創(chuàng)新，打造高效便捷集團(tuán)內(nèi)部結(jié)算系統(tǒng)。

ΔL=(Li-L0)=1.6μm

校準(zhǔn)結(jié)論：該雙光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的放大倍數(shù)誤差小于5%，示值誤差小于2μm，符合JJF 1402—2013《生物顯微鏡校準(zhǔn)規(guī)范》要求。

3 不確定度分析

數(shù)學(xué)模型：

ΔL=(Li-L0)

式中：ΔL為測(cè)量點(diǎn)的示值誤差，mm；Li為測(cè)量點(diǎn)的標(biāo)稱長(zhǎng)度，mm；L0為對(duì)應(yīng)測(cè)量點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)線紋尺長(zhǎng)度，mm。

式中：c1=1；c2=1

標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定：

花粉樣片標(biāo)定誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L0)：

可以取標(biāo)準(zhǔn)量引入誤差e=2μm，

測(cè)量時(shí)瞄準(zhǔn)誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Li)：

瞄準(zhǔn)時(shí)采用單線瞄準(zhǔn)，其瞄準(zhǔn)精度a =60″，系統(tǒng)采用10X目鏡，物鏡放大倍數(shù)40X，這時(shí)顯微鏡系統(tǒng)的整體放大倍率為K=400X，引用生物顯微鏡規(guī)范的公式進(jìn)行計(jì)算，其瞄準(zhǔn)誤差為：

該項(xiàng)瞄準(zhǔn)誤差主要以均勻分布的方式影響，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

擴(kuò)展不確定度

U=k×uc=2×1.2=2.4μm

k=2

顯微鏡視場(chǎng)范圍為0.2mm，則物鏡放大倍數(shù)誤差的測(cè)量不確定度為

4 結(jié)論

通過對(duì)制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)方法的不確定度分析，得到該方法的不確定UΔβ=1.2%，滿足1/3標(biāo)準(zhǔn)器的選擇原則，因此，在沒有直接標(biāo)準(zhǔn)器時(shí)，可以用間接方法，通過制作花粉樣片來校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)。

[1] JJF 1402—2013《生物顯微鏡校準(zhǔn)規(guī)范》

[2] JJF 1071—2010《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》

[3] JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》

[4] 鄔國(guó)耀.萬能工具顯微鏡使用功能的拓展.計(jì)量技術(shù),2002(8)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.4.17