楊麗娟，潘治宇，陳 勇，陶志勇，夏 惠，李正紅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2. 安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030)

內(nèi)嗎啡肽-1對人樹突狀細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的影響

楊麗娟1，潘治宇1，陳 勇2，陶志勇2，夏 惠2，李正紅1

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2. 安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030)

目的 觀察內(nèi)嗎啡肽-1(EM-1)對人外周血來源樹突狀細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的影響。方法 從人外周血中提取和分離單核細(xì)胞，在含重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白細(xì)胞介素-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，6 d后未成熟樹突狀細(xì)胞(imDC)分4組，空白對照組(BLA組)、EM-1組、LPS組、LPS+EM-1組。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組DC表面TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測各組DC中TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 流式結(jié)果顯示，TLR2、TLR 4在imDC表達(dá)較高，隨著DC成熟表達(dá)下降。與BLA組相比，EM-1組DC表面TLR2、TLR4的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組DC表面TLR2、TLR4受體均明顯下調(diào)(P<0.01)。RT-PCR的結(jié)果顯示，與BLA組相比，EM-1干預(yù)后引起DC 表面TLR2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，TLR4 mRNA的變化無差異(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC表面TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 EM-1使DC表面TLR2、TLR4的表達(dá)下調(diào)，EM-1對DC免疫功能的影響可能與DC表面TLR2、TLR4表達(dá)有關(guān)。

內(nèi)嗎啡肽-1；樹突狀細(xì)胞；TLR2；TLR4；免疫功能；抗原提呈細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)由美國學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)，因其在成熟時(shí)伸出許多樹突狀或偽足狀突起而得名[1]，是迄今所知的抗原提呈能力最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)[2]。目前研究證實(shí)在一些自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中DC發(fā)揮了一定的作用。DC可以通過分泌各種具有功能效應(yīng)的細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)T細(xì)胞激活和分化。DC的微生物識別功能主要依賴于表達(dá)在其表面I型跨膜蛋白Toll樣受體(TLR)。TLRs可識別多種多樣的微生物分子結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞壁成分、核酸以及微生物合成的化合物[3]。表達(dá)在DC表面的TLRs，在調(diào)節(jié)DC的分化成熟、分泌各種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、激活初始型T細(xì)胞，以及啟動(dòng)免疫應(yīng)答等方面起著重要的作用[4]。因此，調(diào)控DCs表面TLR的表達(dá)就可以調(diào)節(jié)DC的成熟狀態(tài)和免疫功能，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)和免疫耐受。

內(nèi)嗎啡肽 (endomorphins，EMs)于1997 年由美國神經(jīng)生物學(xué)家 Zadina 等首次報(bào)道，并根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，分為1型(endomorphin-1，EM-1)和2型(endomorphin-2，EM-2)。EMs對Mu阿片受體親和力和選擇性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它生物活性肽，被認(rèn)為是Mu阿片受體的內(nèi)源性配體[5]。EM顯著的作用是其鎮(zhèn)痛作用，但目前大量證據(jù)表明其亦參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[6]。有研究報(bào)道，EM-1影響DC的免疫功能和成熟，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察EM-1對DC的影響作用是否與DC表面的TLR2和TLR4有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 DC培養(yǎng)所用健康人血樣取自本校學(xué)生志愿者，年齡18～23歲(平均20歲)。每份標(biāo)本的采集均征得本人書面同意。

1.1.2 藥品與試劑 DNA MarkerⅠ和總RNA提取試劑(TRIzol) 均購于北京天根公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)原液，購于美國Sigma公司；FITC 標(biāo)記的抗人CD11 抗體購于美國Caltag公司；TLR2、TLR4、β-actin內(nèi)參引物，購于南京金凱瑞生物科技公司；RNA抽提試劑盒，購于立陶宛Fermentas公司；DNA聚合酶，購于日本TaKaRa公司；瓊脂糖、溴化乙錠(EB)購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 人外周血DC誘導(dǎo)培養(yǎng) 抽取健康志愿者的外周靜脈血20 mL，肝素鈉抗凝。PBS等比稀釋，將稀釋后血樣移入淋巴細(xì)胞分離液中，進(jìn)行密度離心(20℃, 2 000 r·min-1, 20 min)，取界面的白膜細(xì)胞，用PBS懸浮細(xì)胞，離心洗滌2次，再用RPMI 1640液體培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010·L-1，加入24孔板中[7]，37℃、5% CO2孵箱貼壁培養(yǎng)3 h后，棄上清，用RPMI 1640輕洗2遍，貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。懸浮細(xì)胞多為淋巴細(xì)胞。貼壁的單核細(xì)胞加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基，采用rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合刺激(終濃度均為106U·L-1)，37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)3 d后，輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞，補(bǔ)充等量細(xì)胞因子和新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至6 d，分組加入脂多糖(LPS，100 μg·L-1)或EM-1(1×10-6mol·L-1)刺激,刺激48 h后，收集細(xì)胞即為正常人外周血來源的DC。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 在細(xì)胞培養(yǎng)d 6，將細(xì)胞分成4組，BLA組：空白對照組，培養(yǎng)過程中不加LPS及EM-1；EM-1組：培養(yǎng)d 6加入EM-1；LPS組：LPS實(shí)驗(yàn)對照組(培養(yǎng)d 6加入LPS)；LPS+EM-1組：培養(yǎng)d 6加入LPS和EM-1。在實(shí)驗(yàn)中LPS的用量均為100 μg·L-1，EM-1的用量均為1×10-6mmol·L-1。

DC的鑒定：①形態(tài)：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。②流式細(xì)胞術(shù)：將收集的懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L-1，加入流式管中，再分別加入FITC 標(biāo)記的抗人CD11 抗體以及同型對照FITC 標(biāo)記的IgG1，避光染色30 min 后，PBS 洗滌3 次，加入300 μL濃度 20 g·L-1多聚甲醛，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC成熟表型，Cellsquest 軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測EM-1對DC表面TLR2、TLR4表達(dá)的影響 收集d 8各組細(xì)胞，并用抗CD11c FITC、抗TLR2 PE、抗TLR4 PE熒光標(biāo)記抗體染色，留取空白管和同型對照管。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)上機(jī)檢測，CellQuest軟件和Flow Jo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 RT-PCR法檢測EM-1對DC中TLR2﹑TLR4 mRNA表達(dá)的影響 將相同組的DC細(xì)胞加2 mL TRIzol，氯仿混勻，加異丙醇離心，加75%的乙醇(預(yù)冷)洗滌RNA沉淀后離心。再加DEPC水溶解， 60℃下孵育10 min助溶。取出2 μL原液置于核酸蛋白測定計(jì)算器上，紫外光度儀檢測OD260/OD280值和RNA的濃度。取總RNA移入EP管，加入oligo(dT)18primer,去離子水至12 μL。進(jìn)行以下反應(yīng)：65 ℃孵育5 min后置于冰上。依次加入Reaction Buffer、RiboLock RNase inhibitor、10 M Dntp mix。37℃孵育5 min后置于冰上。然后加M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL ，至20 μL，混勻后離心；42℃孵育60 min，最后 70℃、10 min以終止反應(yīng)。即獲得cDNA，立即進(jìn)行PCR。引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，PubMed BLAST驗(yàn)證。南京金凱瑞公司生物科技公司合成。各因子及內(nèi)參照引物序列、產(chǎn)物長度如Tab 1所示。

Tab 1 Primer sequences and PCR amplification product length of β-actin, TLR2 and TLR4 gene

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。將凝膠電泳圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)，結(jié)果以條帶灰度值表示，并選擇β-actin作為內(nèi)參，在同樣條件下擴(kuò)增，其表達(dá)與細(xì)胞總RNA呈正比，以電泳圖中各組TLR2、TLR4分別與β-actin的條帶灰度值比值作為目的基因表達(dá)相對水平，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPPS 17.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察人外周血分離的單核細(xì)胞在rhGM-CSF和rhIL-4的聯(lián)合刺激下可分化成未成熟DC，在此過程中，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化。倒置相差顯微鏡下觀察可見，培養(yǎng)d 3細(xì)胞出現(xiàn)毛刺狀突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，DC體積逐漸增大，在d 6突起數(shù)量減少，突起增長，呈長梭形，呈貼壁集落式生長。加入LPS約48 h后，部分細(xì)胞呈長梭形、條索狀，部分細(xì)胞形態(tài)趨向恢復(fù)球形，基本已呈懸浮狀生長。但是與對照組相比，EM-1干預(yù)后DC形態(tài)學(xué)變化不明顯(Fig 1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定DC流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)d 8 DC的表型分子CD11c+細(xì)胞率，結(jié)果顯示DC純度可高達(dá)70%，同時(shí)鏡下觀察DC細(xì)胞形態(tài)典型，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)外周血來源DC體系建立(Fig 2)。

2.3 EM-1對DC Mu受體的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)，Mu受體在DC中均有表達(dá)，Mu受體在imDC表達(dá)較低，并且EM-1干預(yù)可引起imDC上的Mu受體表達(dá)數(shù)目上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在致炎因子LPS作用下，EM-1干預(yù)后DC的Mu阿片受體的數(shù)目上調(diào)明顯(P<0.01)(Tab 2、Fig 3)。

Fig 1 Morphological changes of DC in the induced differentiation process

A：imDC in day 3(400×)；B： imDC in day 6(200×)；C：BLA group DC in day 8(200×)；D：EM-1 group DC in day 8(200×)；E： LPS group DC in day 8(200×)；F： LPS+EM-1 group DC in day 8(200×). Seen under the microscope, with the increased incubation time, the volume of DC increased, the number of projections reduced in the day 6, the length of projections increased. After added LPS approximately 48 h, some cells expressed as fusiform, cords, partially restored cell morphology. However, compared with the control group, the DC morphology did not change significantly in EM-1 group.

GroupMureceptorBLA2.62±0.91EM-16.70±1.23LPS33.67±2.77LPS+EM-152.24±3.46##

##P<0.01vsLPS

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測EM-1對DC表面TLR2、TLR4表達(dá)的影響結(jié)果顯示，TLR2、TLR 4在imDC表面表達(dá)較高，隨著DC成熟表達(dá)下降。與BLA組相比，EM-1組DC上的TLR2、TLR4表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組DC表面TLR2、TLR4受體均明顯下調(diào)(P<0.01)，見Tab 3。

GroupTLR2TLR4BLA79.50±4.6058.86±2.40EM-168.92±4.80*49.67±2.12*LPS41.18±3.9926.87±3.28LPS+EM-110.94±1.98##10.65±2.40##F354.924428.521P0.0000.000

*P<0.05vsBLA；##P<0.01vsLPS

2.5 EM-1誘導(dǎo)對DC表面TLR2 mRNA﹑TLR4 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，與BLA組相比，EM-1干預(yù)后引起DC TLR2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，TLR4 mRNA的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC上TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調(diào)(P<0.05)，見Fig 4。

3 討論

DC是免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可以激活初始T細(xì)胞，具有激發(fā)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受的雙重作用[8-9]。DC在成熟過程中分為前體、未成熟、成熟3個(gè)階段，不同階段抗原提呈能力有所不同。未成熟階段具有強(qiáng)大抗原攝取能力，但因細(xì)胞表面協(xié)同刺激因子低表達(dá)，誘導(dǎo)T細(xì)胞能力較弱。成熟DC表面MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)增加，抗原提呈能力增強(qiáng)，對T細(xì)胞的誘導(dǎo)能力亦明顯增加，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。

Fig 2 Purity of DC detected by flow cytometry

A: Dot plot of DC; B: Dot plot of CD11c+ DC; C: Histogram of CD11c+ DC

Fig 3 Expression of Mu receptor on DC surface A: BLA group；B: EM-1 group；C: LPS group；D: LPS+EM-1 group

Fig 4 Expressions of TLR2 mRNA (A) and TLR4 mRNA (B) in DC

有研究表明，μ阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)，可以介導(dǎo)阿片肽對免疫細(xì)胞的作用。DC作為功能最強(qiáng)大的APC，亦有MOR的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Mu受體在DC中均有表達(dá)，在致炎因子LPS作用下，EM-1干預(yù)后DC的Mu阿片受體的數(shù)目上調(diào)明顯(P<0.01)，與相關(guān)研究結(jié)果相符[11]。EM-1對Mu阿片受體親和力和選擇性遠(yuǎn)高于其它生物活性肽，不僅參與炎癥反應(yīng)，還可通過改變細(xì)胞因子的產(chǎn)生對APC進(jìn)行調(diào)控，這種調(diào)控方式可能通過抑制DC的趨化性進(jìn)而抑制DC對T淋巴細(xì)胞的激活作用[12]。另有文獻(xiàn)顯示，在大鼠誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型中，炎癥爪局部組織和淋巴結(jié)及分泌的滑液中，均發(fā)現(xiàn) EMs的水平有所升高，同時(shí)伴有MOR的高表達(dá)[13-14]。本研究中心前期相關(guān)研究證實(shí)，經(jīng)LPS及EM-1刺激后小鼠DC表面MHC表達(dá)增加[12]，那么EM-1是否還可以通過其他途徑來調(diào)控DC的免疫作用呢？本實(shí)驗(yàn)針對研究較多的DC表面的TLR進(jìn)行研究。TLR是DC和其他免疫細(xì)胞識別病原微生物特征的傳感器，能夠與病毒DNA或細(xì)菌細(xì)胞壁成分(如LPS)等結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)的第一道防線，即先天性免疫應(yīng)答，引起炎癥；由TLR途徑產(chǎn)生的先天性免疫信號經(jīng)由DC繼而引發(fā)以T和B淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主的獲得性免疫應(yīng)答，其在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)天然免疫及誘導(dǎo)獲得性免疫中起到重要作用[15-16]。本文結(jié)果顯示，TLR2、TLR4在imDC表面表達(dá)較高，隨著DC的成熟其表達(dá)下降。并且與BLA組(imDC組)相比，EM-1干預(yù)可引起DC上的TLR2、 TLR4表達(dá)下調(diào)；EM-1和LPS共培養(yǎng)，使DC表面TLR2、TLR4受體明顯下調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示，與Blank組相比，EM-1的干預(yù)可引起DC表面 TLR2 mRNA表達(dá)降低，而TLR4 mRNA的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC上的TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調(diào)，提示EM-1能下調(diào)DC 表面TLR2、TLR4的表達(dá)。TLRs是天然免疫和獲得性免疫的橋梁，可激活機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫。表達(dá)于DC表面上的TLR2和TLR4參與了DC分化成熟的調(diào)節(jié)，TLR2和TLR4活化后可經(jīng)過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)DC的分化成熟，并釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化。因此，抑制DC表達(dá)TLR2和TLR4可能會(huì)在一定程度上阻斷或減少它們對DC的活化作用，從而達(dá)到抑制DC的抗原提呈作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EM-1下調(diào)DC表面TLR2、TLR4的表達(dá)，提示EM-1可能通過抑制DC表面TLR的表達(dá)，阻斷了TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的DC的成熟和細(xì)胞因子的分泌。

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Effect of endomorphin-1 on TLR2 and TLR4 expressions of dendritic cells from human blood

YANG Li-juan1,PAN Zhi-yu1,CHEN Yong2,TAO Zhi-yong2,XIA Hui2,LI Zheng-hong1

(1.DeptofPhysiology,2.DeptofInfectionandImmunityKeyLaboratoryofAnhuiProvince,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui230030,China)

Aim To observe the effect of endomorphin-1(EM-1) on TLR2 and TLR4 expressions of dendritic cells (DC) from human peripheral blood. Methods Monocytes isolated from human peripheral blood mononuclear cells were cultured in medium containing recombinant human interleukin-4 and recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor. After six days of culture, the immature dendritic cells (imDC) were divided into four groups, the control group (BLA group), EM-1 group, LPS group and LPS + EM-1 group. After 2 days of culture, the expressions of TLR2 and TLR4 were determined by fluorescence activated cell sorter(FACS). The expressions of TLR2 and TLR4 at mRNA level in DC were detected by RT-PCR. Results The FACS results showed that the expressions of TLR2 and TLR4 in imDC were higher, and their expressions were decreased with the maturation of DC. Compared with BLA group, the expressions of TLR2 and TLR4 in DC were down-regulated in EM-1 group (P<0.05).Compared with LPS group, TLR2, TLR4 on DC surface were significantly lower in LPS+EM-1 group (P<0.01). RT-PCR results showed that compared with BLA group, EM-1 intervention induced TLR2 mRNA expression was down-regulated significantly (P<0.01), there were no significant changes of TLR4 mRNA expression (P>0.05). mRNA expressions of TLR2 and TLR4 on DC in LPS+EM-1 group were lower than those in LPS group (P<0.05). Conclusions EM-1 enables the down-regulation of the expressions of TLR2 and TLR4 on DC surface, the effects of EM-1 on immune function may be associated with TLR2 and TLR4 expressions on DC surface.

endomorphin-1; dendritic cells; TLR2; TLR4; immune function;APC

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.023.html

2015-02-24,

2015-03-27

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No KJ2011A202);蚌埠醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No Bykf13A10)

楊麗娟(1977-)，女，碩士，講師，研究方向：神經(jīng)生理學(xué)，E-mail:bbmeylj@163.com; 潘治宇(1983-)，女，碩士生，研究方向：免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，共同第一作者，E-mail:panzhiyu969@sohu.com； 李正紅(1970-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)生理學(xué)，通訊作者,E-mail: lizhbbmc@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.022

A

1001-1978(2015)05-0704-05

R329.24；R341.6；R392.11