馮青，賴柯華，黃偉康，劉禹杉，李江，章程輝，范詠梅

海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228

茚蟲威對斑馬魚的急性毒性及遺傳毒性

馮青，賴柯華，黃偉康，劉禹杉，李江，章程輝，范詠梅*

海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228

茚蟲威屬噁二嗪類新型廣譜高效殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要作用，近年來隨著用量的增加，由此產(chǎn)生的對水生生物的影響越來越受到重視。使用斑馬魚進(jìn)行茚蟲威的急性毒性作用實驗，并采用微核試驗、彗星試驗、Annexin V-FITC/PI雙染色檢測觀察染毒后的斑馬魚是否被誘導(dǎo)產(chǎn)生遺傳毒性。結(jié)果表明：在24 h、48 h、72 h、96 h，茚蟲威LC50值分別為2.263 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.133 mg·L-1。茚蟲威對斑馬魚急性毒性屬中等毒性。96 h茚蟲威濃度為1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1時，斑馬魚的微核率與對照組相比達(dá)差異極顯著水平(P<0.01)。采用彗星試驗檢測斑馬魚肝臟DNA損傷，結(jié)果顯示斑馬魚暴露于高濃度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚蟲威后，與對照組相比，斑馬魚的DNA損傷均表現(xiàn)為極顯著差異(P<0.01)。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀法檢測，結(jié)果表明染毒后24 h斑馬魚肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，茚蟲威對斑馬魚短期染毒后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出遺傳毒性。

茚蟲威；斑馬魚；急性毒性；遺傳毒性；凋亡；微核試驗；彗星試驗；Annexin V-FITC/PI

茚蟲威(indoxacarb)，美國杜邦公司于1992年開發(fā)的新型鈉通道阻斷型氨基甲酸酯類殺蟲劑，用于棉花、果樹、蔬菜和林木等作物[1]。隨著該藥劑專利保護(hù)于2011年12月21日到期[2]，國內(nèi)很多廠家開始生產(chǎn)該藥劑的原藥和母藥，該藥劑在國內(nèi)的銷售量大幅度增加，故茚蟲威在水體和環(huán)境中的殘留及影響不容忽視。

在環(huán)境毒理的研究中，農(nóng)藥、工業(yè)污水等對脊椎動物作用方面，斑馬魚已成為一種極好的實驗?zāi)Ｊ絼游颷3-4]。而在茚蟲威對斑馬魚作用的研究方面，國內(nèi)學(xué)者有做茚蟲威(SC)對斑馬魚的急性毒性研究[5],以及該商品藥與表面活性劑對斑馬魚的急性毒性和聯(lián)合毒性研究[6]。在國外的相關(guān)研究中，僅見聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)[7]、澳大利亞國家農(nóng)藥和獸藥注冊局 (NRA)[8]、歐盟委員會衛(wèi)生與消費者保護(hù)總署[9]等對茚蟲威原藥的評估報告，其中藍(lán)鰓太陽魚的LC50是0.9 mg·L-1、虹鱒魚的LC50為0.65 mg·L-1、鯉魚的LC50為0.969 mg·L-1，鯰魚的為0.29 mg·L-1，并采用茚蟲威對沙門氏菌、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、大鼠的肝細(xì)胞、人類淋巴球、鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測其基因誘變的情況，結(jié)果顯示為陰性。綜上所述，關(guān)于茚蟲威原藥對斑馬魚的急性毒性、遺傳毒性的研究在國內(nèi)外均無明確報道。而農(nóng)藥對生物的遺傳毒性的影響也越來越受到重視，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥能引起DNA損傷[10-11]。

本研究采用微核試驗和彗星試驗檢測是否存在DNA損傷，用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞凋亡。其中微核試驗已廣泛應(yīng)用于藥品、農(nóng)藥、環(huán)境污染物等遺傳毒性的檢測[12]，彗星試驗又稱為單細(xì)胞凝膠電泳，是被普遍應(yīng)用于毒理學(xué)上有核細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)的檢測方法[13-14]；Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀法是目前定量檢測細(xì)胞凋亡的理想方法[15]。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

斑馬魚(Brachydanio rerio)為AB系斑馬魚，引進(jìn)自國家斑馬魚中心。挑選同一批生長為6個月，且體態(tài)健康的斑馬魚。其平均體長2～3 cm，平均體重0.2 g，無死亡情況。實驗前24 h及實驗期間不喂食。

實驗用水為曝氣24 h以上的去氯自來水，溫度(25±1) ℃，實驗過程中測定實驗用水的pH為7.4～8.2，溶氧量為85%～90%。

1.2 供試藥品

茚蟲威(含量98%，南京樂邦化工有限公司)、高錳酸鉀(GR，廣州化學(xué)試劑廠)、乙酸乙酯(AR，廣州化學(xué)試劑廠)、吐溫80(索萊寶科技有限公司)、胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒G002-1(南京建成生物工程研究所)、GelRed核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)

1.3 斑馬魚急性毒性試驗

斑馬魚急性實驗參考《OECD,Guidelines for the testing of chemicals，F(xiàn)ish acute toxicity test》[16]進(jìn)行。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，正式實驗設(shè)置茚蟲威濃度為1.65、1.81、1.97、2.16、2.36 mg·L-1，設(shè)曝氣水空白對照和溶劑對照。每個實驗容器中放入10尾斑馬魚。分別在24 h、48 h、72 h、96 h時檢查受試斑馬魚的存活狀況及溶氧量和pH值。同時選取重鉻酸鉀(GR)作為參比物，重鉻酸鉀濃度分別為100、150、225、338、506 mg·L-1，測定斑馬魚的敏感性24 h-LC50。

1.4 微核試驗

從每個濃度中隨機(jī)取3只試驗魚。用濾紙拭去斑馬魚表面的水，斷尾，用經(jīng)過肝素鈉濕潤過的毛細(xì)血管吸取外周血液，滴至潔凈的載玻片上，常規(guī)操作制取血涂片，每尾魚制取2張片，待晾干后用甲醇固定10 min左右，再用10%吉姆薩(Giemsa)溶液液染色25 min，立即用pH=6.8的磷酸緩沖液沖洗干凈，晾干后，使用顯微鏡OLYMPUS BX51圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0觀察并拍照。每張玻片統(tǒng)計3 000個細(xì)胞，并按下列公式計算微核細(xì)胞的千分率[18]。

微核率=觀察到的微核細(xì)胞數(shù) / 觀察的細(xì)胞總數(shù)×1000‰

1.5 Annexin V-FITC/PI檢測

解剖出斑馬魚幼魚肝臟，采用胰蛋白酶消化液在室溫下消化20～30 min，再以血清封閉，停止消化，200目篩網(wǎng)過濾。離心后，PBS輕輕重懸，并計數(shù)，細(xì)胞數(shù)應(yīng)不低于1×105個檢測方法參照試劑盒說明書進(jìn)行，采用FACSCanto流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測。

表1 茚蟲威對斑馬魚的毒性Table 1 Indoxacarb toxicity to B.rerio

圖1 對照組及茚蟲威實驗組受試斑馬魚微核圖

圖2 斑馬魚外周血紅細(xì)胞核異?，F(xiàn)象

表2 茚蟲威對斑馬魚外周血紅細(xì)胞微核率的影響Table 2 Effects of indoxacarb on micronucleus of peripheral red blood cells in B.rerio

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05);**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

Note: *indicate significant differences compared with comparison group(P<0.05);**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

1.6 彗星試驗

按1.5步驟制備肝臟懸浮液，參考侯欣欣[17]的實驗方法并進(jìn)行改進(jìn)，制備單細(xì)胞凝膠電泳膠板，細(xì)胞裂解1 h，堿性解旋20 min，在電壓25 V，電流300 mA，4 ℃條件下避光電泳20 min。中和堿性后，酒精逐級脫水，用GelRed 100×對其染色，紫外光下用顯微鏡OLYMPUS BX51 圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 17.0軟件，計算24 h、48 h、72 h、96 h的LC50值、相應(yīng)95%置信區(qū)間并進(jìn)行回歸分析，以R2表示相關(guān)程度。對不同處理組之間實驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析和回歸分析，以相關(guān)系數(shù)R表示相關(guān)程度。

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚的急性毒性效應(yīng)

本實驗結(jié)果顯示：96 h時LC50值為2.13 mg·L-1，置信區(qū)間為1.64～2.60 mg·L-1，進(jìn)行線性回歸y=10.99x-19.68，其中R2為0.87，相關(guān)性良好(表1)。24 h-LC50到96 h-LC50由2.24 mg·L-1減少至2.13 mg·L-1，表明隨著時間的增長，茚蟲威對斑馬魚的毒性也隨之升高。

2.2 微核試驗

茚蟲威藥劑處理后的斑馬魚，其外周紅細(xì)胞出現(xiàn)微核(圖1)。微核的千分率的統(tǒng)計結(jié)果表明(表2)，與陰性對照組比較，受試組濃度為1.65、1.81、1.98、2.16 mg·L-1的斑馬魚細(xì)胞微核率分別為：9.65‰±1.36‰，10.14‰±0.71‰，12.67‰±1.03‰，15.37‰±2.24‰。

結(jié)果表明，未成熟紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞總數(shù)目比值(PCE/NCE)在0.8～1.1之間。當(dāng)受試濃度為1.65 mg·L-1和1.81 mg·L-1，微核率升高，但與對照組差異不顯著；濃度為1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1時，微核率上升幅度較大，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。對紅細(xì)胞微核率進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為Y=0.023X-0.02 (R=0.86)。

微核試驗中，除微核外也觀察到了，核質(zhì)外凸型的核異常中微核與主核之間有細(xì)絲相連的現(xiàn)象，比例小于0.1% (圖2)。

2.3 彗星試驗

采用不同濃度茚蟲威對斑馬魚幼魚處理后，其肝臟細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的DNA損傷(圖3)。由表3可知，茚蟲威對斑馬魚肝臟細(xì)胞DNA彗星Olive尾矩的影響，在24 h時，在1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1時彗星尾矩的值與對照組相比呈極顯著差異(P<0.01)；48 h時各濃度的彗星尾矩明顯增加，在與對照組相比，均表現(xiàn)為極顯著差異(P<0.01)，且在1.98 mg·L-1濃度時，DNA的損傷最大。72 h和96 h時，各濃度的彗星尾矩與對照組相比均表現(xiàn)出及顯著性差異(P<0.01)。

同一濃度處理，隨著時間的變化其DNA彗星Olive尾矩也存在差異，暴露24 h時，茚蟲威對斑馬魚肝臟的DNA損傷處于較低水平；在48 h DNA彗星Olive尾矩出現(xiàn)最大值；72 h和96 h時DNA彗星Olive尾矩較48 h時有所減少。

圖3 斑馬魚肝臟細(xì)胞DNA損傷的彗星實驗圖像

表3 茚蟲威對斑馬魚肝臟細(xì)胞DNA損傷程度(Olive尾矩)的影響Table 3 Effect of indoxacarb on B.rerio liver comet olive tails

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05);**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

Note: *indicate significant differences compared with control group(P<0.05);**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

表4 不同時間段不同茚蟲威濃度下斑馬魚肝臟的細(xì)胞凋亡率Table 4 The apoptotic result of liver cells in B.rerio at different time treated with different concentration of in indoxacarb

注：**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

Note:**indicate extremely significant differences compared with control group (P<0.01).

圖4 不同濃度茚蟲威暴露24 h對斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡的影響

圖5 不同濃度茚蟲威暴露96 h對斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Annexin V-FITC/PI檢測

由圖4和表4的Annexin V-FITC/PI檢測結(jié)果可知，與對照組相比，在藥劑處理斑馬魚24 h后，其肝臟細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1組的細(xì)胞凋亡率分別為18.30%、22.50%、27.00%和30.40%，與對照組相比存在極顯著差異。肝臟細(xì)胞凋亡率隨著茚蟲威濃度的增加呈遞增趨勢，且茚蟲威濃度與斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率R=0.99(P<0.01)。

在處理后48 h，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.97 mg·L-1、2.16 mg·L-1組的細(xì)胞凋亡率分別為2.10%、0.40%、3.70%和0.70%(表4)，空白對照和溶劑對照保持在較低水平，斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率與茚蟲威濃度，不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系(R=-0.83，P<0.05)。茚蟲威處理72 h后，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.97 mg·L-1、2.16 mg·L-1組的斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率分別為3.20%、0.50%、0.60%和3.60%，空白對照和溶劑對照也保持在較低水平，斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率與茚蟲威濃度不存在劑量-效應(yīng)關(guān)系(R=0.13，P<0.05)。

茚蟲威處理后96 h時，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1組的細(xì)胞凋亡率分別為0.50%、0.80%、3.60%和7.00%(如圖5、表4)。在1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1肝臟細(xì)胞凋亡率與對照相比差異極顯著。

3 討論(Discussion)

本研究結(jié)果表明，急性毒性試驗中，陽性對照重鉻酸鉀對斑馬魚的24 h-LC50值為241 mg·L-1，在200～400 mg·L-1之間，參比物重鉻酸鉀試驗結(jié)果證明斑馬魚的敏感性滿足實驗所需，符合OECD的標(biāo)準(zhǔn)[17]。茚蟲威原藥對斑馬魚幼魚的急性毒性96 h-LC50值為2.13 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.64～2.60 mg·L-1，屬中毒范疇。俞瑞鮮等[5]在茚蟲威商品藥(15%茚蟲威懸浮劑)對斑馬魚影響的研究中測得96 h-LC50的值為0.37 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.37～0.46 mg·L-1，屬高毒范疇。說明茚蟲威原藥的毒性低于商品藥，這種因溶劑的不同而實驗結(jié)果不同的情況在農(nóng)藥急性毒性研究中比較常見，如甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對斑馬魚的毒性也是如此[18-19]。

在遺傳毒性物質(zhì)的誘導(dǎo)下，真核生物細(xì)胞會出現(xiàn)微核和核異常的現(xiàn)象。農(nóng)藥在急性試驗中常會誘導(dǎo)魚類微核率和核異常率的上升，造成遺傳損傷，如草甘膦[20]，戊氰菊酯[21]、拉特拉津[22]等。在本研究的微核試驗中，未成熟紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞總數(shù)目比值(PCE/NCE)在0.8～1.1之間，均屬于正常范圍(0.6～1.2)。96 h時處理組1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1的斑馬魚外周血細(xì)胞的微核率明顯增多，并與對照組的差異達(dá)極顯著水平。同時觀察到微核與主核之間有細(xì)絲相連的核外突的核異?，F(xiàn)象(如圖2)，可能是茚蟲威對細(xì)胞核產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致核外突而形成微核，這也符合以主核外突形成微核的學(xué)說[23-24]，其他學(xué)者在鯽魚[25]、黃鱔[26]的外周血細(xì)胞的微核和核異常的研究中也驗證了上述學(xué)說。本試驗結(jié)果表明，茚蟲威可以誘發(fā)斑馬魚幼魚外周血細(xì)胞微核和核異常，具有潛在的遺傳毒性。

彗星試驗中，彗星遷移的遠(yuǎn)近與松動釋放的多少并不完全一致，本實驗參考Olive尾矩(Olive tail moment)，能夠更加全面地評價DNA的損傷程度[27]，在吡蟲啉、噻蟲嗪[10]、毒死蜱[17]和莠去津[28]等對斑馬魚肝臟DNA損傷的研究中，采用此指標(biāo)評價農(nóng)藥對斑馬魚的DNA損傷。在48 h時，茚蟲威對斑馬魚肝臟的DNA損傷達(dá)到最大值，細(xì)胞核變得疏松，體積也逐漸變大。在72 h和96 h時，低濃度的1.65 mg·L-1和1.81 mg·L-1處理的肝臟細(xì)胞DNA損傷雖有所恢復(fù)，但和對照組相比差異仍極顯著。斑馬魚暴露于高濃度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚蟲威后斑馬魚的肝臟DNA損傷均表現(xiàn)為極顯著差異，進(jìn)一步表明茚蟲威對斑馬魚存在遺傳毒性。

Annexin V-FITC/PI雙染法[29]等可檢測早期少量細(xì)胞凋亡。該方法使用能特異性結(jié)合凋亡時外翻的細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸[30]的AnnexinV作為探針，并且，利用碘化丙啶(PI)不能透過完整細(xì)胞膜的特點，可以將凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞、損傷細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)別開，武凡等[31]也證實此方法是理想的定量檢測肝細(xì)胞凋亡的方法。本研究結(jié)果表明在24 h時，斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率明顯升高，1.65 mg·L-1、1.81 mg·L-1、1.98 mg·L-1、2.16 mg·L-1組的細(xì)胞凋亡率分別為18.3%、22.5%、27%和30.4%，與對照組相比凋亡率存在顯著性差異。在24 h時茚蟲威誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡，且斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡率與茚蟲威濃度相關(guān)性顯著(R=0.99，P<0.01)，凋亡率隨著茚蟲威濃度的升高而增加。

本試驗結(jié)果表明，茚蟲威短時間暴露即會造成DNA損傷，并于24 h誘導(dǎo)斑馬魚幼魚產(chǎn)生早期細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

本研究中，茚蟲威對斑馬魚幼魚實驗為短期暴露實驗，而長時間低劑量暴露是否會產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，或者是否存在其他遺傳毒性等問題則需要進(jìn)一步的研究。

致謝：感謝海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)實驗室和海南大學(xué)?？谑协h(huán)境毒理學(xué)實驗室的同學(xué)們對本實驗的幫助和支持。

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Acute and Genetic Toxicity of Indoxacarb to Zebrafish (Brachydaniorerio)

Feng Qing,Lai Kehua,Huang Weikang,Liu Yushan,Li Jiang,Zhang Chenghui,Fan Yongmei*

College of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China

14 October 2014 accepted 20 April 2015

Indoxacarb is a new and efficient broad-spectrum oxadiazine insecticide,which plays a vital role in agricultural production.With the increase of indoxacarb dosage,more attention is paid to the effects of indoxacarb on aquatic organisms and water quality.Acute toxicity of indoxacarb to Brachydanio rerio was studied,and micro nuclear test,DNA Ladder and Annexin V and propidium iodide double staining were used to detect whether indoxacarb would induce apoptosis,to explore the preliminary toxicity mechanism of indoxacarb.The results showed that indoxacarb was moderately toxic to B.rerio,and 24 h-LC50,48 h-LC50,72 h-LC50and 96 h-LC50of acute toxicity were 2.263 mg·L-1,2.184 mg·L-1,2.184 mg·L-1and 2.133 mg·L-1respectively.B.rerio micronucleus rates in concentration of 1.98 and 2.16 mg·L-1were extremely significant difference (P<0.01),showing that genetic toxicity exists in zebra fish.In the comet assay,the result showed that in the indoxacarb concentration of 1.98 and 2.16 mg·L-1,the significant liver DNA damage were found compared to the control (P<0.01).And the result of Annexin V-FITC /PI revealed that apoptosis happened in the liver cells after B.rerio was treated by indoxcarb for 24 h.The experimental results further proved that the short-term exposure to indoxacarb induce apoptosis in B.rerio,which indicate genetic toxicity of indoxacarb.

indoxacarb; Brachydanio rerio; acute toxity; genotoxicity apoptosis; micronucleus test; comet assay; Annexin V-FITC/PI

國家科技支撐計劃項目(2012BAK01B05)；海南省標(biāo)準(zhǔn)化項目(2012-004)；海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2014-12)

馮青(1988-),女,碩士研究生,研究方向為農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué),E-mail: wodemaitiandi@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yongmeifan@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141014001

2014-10-14 錄用日期：2015-04-20

1673-5897(2015)4-226-09

R994.6

A

范詠梅(1968-)，女，教授，碩導(dǎo)，農(nóng)藥與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全系主任，主要研究方向農(nóng)藥環(huán)境毒理，園藝作物病蟲害防治與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估。

馮青，賴柯華，黃偉康,等.茚蟲威對斑馬魚的急性毒性及遺傳毒性[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2015,10(4): 226-234

Feng Q,Lai K H,Huang W K,et al.Acute and genetic toxicity of indoxacarb to zebrafish (Brachydanio rerio) [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 226-234 (in Chinese)