高瑞昌,陳 輝,,李來好,于 剛,吳燕燕,胡 曉,陳勝軍，*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心,廣東廣州 510300)

低分子量羅非魚眼透明質(zhì)酸的制備及其抗氧化性研究

高瑞昌1,陳 輝1,2,李來好2,于 剛2,吳燕燕2,胡 曉2,陳勝軍2，*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心,廣東廣州 510300)

本研究采用微波結合過氧化氫+抗壞血酸法降解羅非魚眼透明質(zhì)酸,通過改變降解條件制備相對分子量分別為小于5、5～10、10～30、30～60ku的低分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)。研究比較了不同分子量LMWHA對·OH、DPPH自由基的清除作用以及還原力的大小。結果顯示,隨著LMWHA分子量的降低其對DPPH的清除率以及還原力增大,而對·OH的清除率減小,這種現(xiàn)象可能與LMWHA清除自由基的作用機理有關,LMWHA清除DPPH自由基以及還原力的大小依賴于其雙鍵的數(shù)量,而清除·OH能力的大小則依賴于LMWHA鏈上羥基以及其螯合過渡金屬離子的能力。實驗證明低分子量透明質(zhì)酸具有良好的抗氧化性。

羅非魚眼,透明質(zhì)酸,降解,抗氧化

自由基在生物體新陳代謝的過程中不斷產(chǎn)生,適量的自由基對維持人體的正常生理活動必不可少,如促進細胞的增殖分化、協(xié)助白血球吞噬微生物、參與蛋白質(zhì)的合成等,但當其量超出一定水平的時候就會對人體造成較大的損害[1]。自由基能攻擊細胞膜上的糖蛋白、磷脂,導致細胞膜的損害,引起細胞的破壞和突變[2]；自由基能使生物體的大分子物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生氧化,從而加速人體的衰老,引起各種疾病,如心臟病、關節(jié)炎、白內(nèi)障、癌癥等[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),自然界中的抗氧化物質(zhì)種類繁多,包括酚類、糖類、蛋白類、肽類,黃酮類等化合物,這些抗氧化劑通過直接或者間接的方式清除生物體內(nèi)的自由基,從而減少自由基對生物體的損害。天然抗氧化劑安全、高效,使得其能在醫(yī)藥、食品、化妝品中得到廣泛的利用。

表1 不同分子量LMWHA的制備Table 1 The preparation of LMWHA with different molecular weight

透明質(zhì)酸是一種活性多糖,其生物活性和分子量大小具有一定的相關性,LMWHA具有大分子量透明質(zhì)酸所不具有的特殊生理功能,例如促進細胞增殖、調(diào)節(jié)機體的免疫功能、抗癌[5]、創(chuàng)傷修復[6]等。本文利用微波結合過氧化氫+抗壞血酸法降解羅非魚眼透明質(zhì)酸,制備分子量不同的LMWHA,并通過其研究對·OH、DPPH·的清除及還原力的大小考察LMWHA的抗氧化能力,利用紫外、紅外光譜對其結構進行分析并初步探討其抗氧化的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

透明質(zhì)酸 實驗室自制,見實驗方法；抗壞血酸、無水乙醇、咔唑、濃硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、水楊酸、FeSO4、鐵氰化鉀、三氯乙酸、DPPH以上試劑均為分析純；30% H2O2、PBS緩沖液(pH6.6)。

水浴震蕩鍋THZ-82 金壇市精達儀器制造廠；UV3紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；冷凍離心機 3K30,德國Sigma公司；真空冷凍干燥機 ALPHA1-4,德國Sigma公司；pH計 PE20,梅特勒托利多儀器有限公司；烏氏粘度計(0.5～0.6mm):上海申立玻璃儀器有限公司；紅外光譜儀 IRAffinity-1,島津；微波消解儀 MAS-Ⅱ,上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚眼透明質(zhì)酸的提取方法 參考文獻[7-8]取未解凍的羅非魚眼若干,取出玻璃體,脫脂,干燥后稱取適量的玻璃體,加入0.2mol/L NaCl,攪勻,調(diào)節(jié)溶液pH,加入適宜的復合酶(胰蛋白酶和復合蛋白酶按酶活力1∶1混合),超聲波處理一段時間后放入40℃水浴震蕩鍋中酶解提取,待其酶解完畢后進行滅酶,在6000r/min離心10min,取上清液超濾濃縮,加入乙醇進行沉淀,將沉淀的粗品利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)進行純化,利用離子交換層析進一步純化,經(jīng)透析后冷凍干燥,得到透明質(zhì)酸。

1.2.2 低分子量透明質(zhì)酸的制備 前期研究顯示改變HA降解時溶液的pH、過氧化氫的加入量以及H2O2∶VC就可以得到不同相對分子量的透明質(zhì)酸[7-8]。據(jù)此,配制一定濃度的HA溶液,按表1工藝條件制備相對分子量不同的LMWHA,分別命名為LMWHA1、LMWHA2、LMWHA3、LMWHA4。

1.2.3 低分子量透明質(zhì)酸清除DPPH·能力的測定 二苯代苦味?；?DPPH)能溶于有機溶劑,是一種相對穩(wěn)定的自由基,其化學結構以氮為中心,其最大吸收波長為517nm,若對其提供質(zhì)子,自由基被清除,吸光值下降,下降越多表明物質(zhì)的抗氧化能力越強,因此其可以用來作為評價抗氧化劑抗氧化能力的評價指標。該法反應速度快、操作方便且反應靈敏,因此在評價天然抗氧化劑的抗氧化性能時最常使用[9]。

采用式(1)計算LMWHA對DPPH的清除率:

式(1)

1.2.4 低分子量透明質(zhì)酸清除·OH能力的測定 根據(jù)Fenton反應原理可知,H2O2和FeSO4相互作用可以產(chǎn)生羥自由基,而水楊酸可以捕獲羥自由基生產(chǎn)有色物質(zhì),該物質(zhì)在510nm處有最大吸收；當向體系中加入抗氧化劑時,就會清除羥自由基,使得有色物質(zhì)的含量下降,510nm處吸光值降低[4]。

參考Wei Liu等[12]的方法并略作改進,吸取1mL FeSO4(3mmol/L)放置比色管中,然后依次吸取1mL水楊酸-乙醇(3mmol/L)溶液和1mL不同濃度的LMWHA樣液放置該比色管中,最后加入反應啟動劑H2O2,混勻,37℃水浴30min,測量510nm處溶液的吸光值Ai；同理用水代替樣液測量空白對照液的吸光值A0；用水代替水楊酸-乙醇溶液測量樣品溶液的本底吸光值Aj,以消除樣品本身的吸收對測量的影響。根據(jù)LMWHA濃度和清除率的關系得出清除率為50%時LMWHA的濃度,即為IC50。

根據(jù)式(2)計算·OH清除率:

式(2)

1.2.5 低分子量透明質(zhì)酸還原力的測定 抗氧化劑和鐵氰化鉀相互作用時,將其還原成亞鐵氰化鉀,而亞鐵氰化鉀能在FeCl3的作用下生成普魯士蘭,該物質(zhì)在700nm有最大光吸收,因此可以根據(jù)反應液在700nm處吸光值的大小比較物質(zhì)的抗氧化能力。

參考Sarikurkcu等[13]的方法并略作改進,取1mL不同濃度的LMWHA溶液,依次加入1mL磷酸鹽緩沖液和1mL K3Fe(CN)6(1%),混勻,50℃水浴20min。取出降至室溫,吸取10%的三氯乙酸1mL加至反應液中以終止反應,然后于4500r/min下離心10min,吸取2mL上清液,分別加入2mL蒸餾水、0.5mL FeCl3(0.1%)繼續(xù)反應10min,測定溶液在700nm處的吸光度,以1mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白。

1.2.6 紫外光譜 配制濃度為0.25mg/mL的樣品溶液,在波長190～400nm進行紫外掃描得到透明質(zhì)酸的紫外光譜[14]。

1.2.7 紅外光譜 稱取干燥的透明質(zhì)酸樣品4～8mg,將其利用溴化鉀壓片法進行處理,然后利用紅外光譜儀對樣品在400～4000cm-1的范圍內(nèi)進行掃描,得到樣品的紅外光譜[14]。

1.2.8 透明質(zhì)酸分子量的測定 用NaCl溶液配制不同濃度的透明質(zhì)酸溶液,利用烏氏粘度計測量流出時間,根據(jù)式(3)和(4)分別計算出相對粘度ηr、比粘度ηsp,然后分別以透明質(zhì)酸濃度Ci、ηsp/Ci為橫縱坐標作圖,進行線性回歸,直線與Y軸的交點即為特性粘度[η],根據(jù)式(5)求出透明質(zhì)酸的相對分子質(zhì)量[15]。

式(3)

ηsp=ηr-1

式(4)

[η]=3.6×10-4Mr0.78

式(5)

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理主要采用Excel、origin及Spss數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結果與分析

2.1 透明質(zhì)酸的主要理化指標分析

通過對所得羅非魚透明質(zhì)酸各理化指標進行測定,表2中數(shù)據(jù)顯示多得到的透明質(zhì)酸的純度符合英國藥典要求,以葡萄糖醛酸含量表示純度為40.40%。

表2 HA的主要理化指標Table 2 The quality standard of HA

注:說明:透明質(zhì)酸在260 nm處的吸光值及葡萄糖醛酸的含量均可以表征透明質(zhì)酸的純度[15]。

2.2 利用方法1.2.2制得不同分子量的透明質(zhì)酸分子量

通過烏氏粘度計測量法對制備的透明質(zhì)酸的分子量進行了分析,分子量區(qū)間和相對分子量分布如表3所示。通過對工藝條件的調(diào)整可使透明質(zhì)酸進行定向降解,以獲得不同分子量區(qū)間的低分子量透明質(zhì)酸。

表3 LMWHA的分子量Table 3 The molecular weight of LMWHA

2.3 降解方法對透明質(zhì)酸紫外光譜的影響

由圖1可知,降解前后HA的紫外光譜略有差異,且隨著的分子量的減小差異性越大。LMWHA在260nm處均出現(xiàn)不同程度的吸收,分子量越小吸收越大,說明降解對HA的微結構造成了影響,即在基團的某些鍵上造成了微小的變化,這可能源于降解時主鏈斷裂或者脫氫反應產(chǎn)生的不飽和結構,Kim等人利用伽馬射線降解透明質(zhì)酸時,降解產(chǎn)物在265nm處出現(xiàn)吸收峰,隨著射線劑量的加強吸收峰值越大[16]。

圖1 不同分子量LMWHA的紫外圖譜Fig.1 UV spectra of LMWHA with different molecular weight

2.4 降解方法對透明質(zhì)酸紅外光譜的影響

由圖2可知,低分子量透明質(zhì)酸和HA的紅外吸收光譜一致,說明降解未對HA的基本結構造成較大影響。二者在3417.90cm-1處均有較強的吸收峰,此處為O-H、N-H的伸縮振動；在2935.66cm-1處有吸收,此處為C-H的伸縮振動,說明存在多甲基結構；1648.46、1412.54cm-1處分別為C=O、C-O的伸縮振動的吸收峰,1141.86、1076.28、1041.56cm-1分別代表C-O-C(氧橋)、C-O(六元環(huán))和C-OH 結構；1564.63cm-1處為C-N伸縮振動的吸收峰,1317.37cm-1為O-H、N-H彎曲振動的吸收峰[17]。

圖2 不同分子量LMWHA的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of LMWHA with different molecular weight

2.5 不同分子量透明質(zhì)酸的DPPH·清除力的比較

由圖3可知,不同分子量透明質(zhì)酸清除DPPH·的效果均與HA的濃度 正相關,隨著濃度的增大清除率升高。LMWHA1的清除效果最好,明顯大于LMWHA2、LMWHA3、LMWHA4,在各濃度條件下均差異性顯著(p<0.05),LMWHA2與LMWHA4差異性顯著(p<0.05),而LMWHA2與LMWHA3、LMWHA3與LMWHA4差異性不顯著(p>0.05)。當LMWHA1濃度為5mg/mL時,清除率達到89%,而此濃度下LMWHA2、LMWHA3、LMWHA4對DPPH·的清除率分別為49%、43%、38%,其值隨著相對分子量的增大而增大,說明LMWHA清除DPPH·的能力和其相對分子量存在一定的相關性,分子量越大清除能力越差,這與鄒朝暉等人的研究結果類似,隨著輻照強度的增加HA的分子量逐漸下降,其清除DPPH·的能力也隨之增強[18]。LMWHA的清除DPPH·的能力可能和其在260nm處的吸收有關,吸收越強其清除能力越強,而該波長的光吸收說明有雙鍵的存在[16],微波結合過氧化氫+抗壞血酸降解法可能使得HA的吡喃羧酸環(huán)產(chǎn)生雙鍵,且隨著降解強度的增大雙鍵數(shù)量越多,清除DPPH·的能力越強,Choi等人的研究也得到了類似的結果[7],因此LMWHA清除DPPH·的能力可能和其雙鍵有關。

圖3 不同分子量LMWHA對DPPH自由基的清除作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of LMWHA with different molecular weight

2.6 不同分子量透明質(zhì)酸·OH清除率效果的比較

由圖4可知,不同分子量大小的LMWHA均有較強的清除羥自由基的能力,且清除能力差異性較小,只在濃度為5mg/mL時LMWHA1、LMWHA2同LMWHA3、LMWHA4差異性顯著(p<0.05),其他條件下四種LMWHA對羥自由基的清除率差異性均不顯著(p>0.05)。LMWHA1、LMWHA2、LMWHA3、LMWHA4的IC50分別為4.39、4.64、4.78、4.82mg/mL,由IC50可知,隨著LMWHA分子量的下降,其清除羥自由基的能力呈現(xiàn)小幅度降低,說明分子量的大小對HA清除·OH的能力有一定影響,但不是很顯著。鄒朝暉等人[18]利用60Co γ射線降解HA,隨著輻照強度的增加HA的分子量逐漸下降,其清除·OH的能力也隨之下降；楊文鴿等人[19]利用過氧化氫結合抗壞血酸法降解龍須菜多糖,降解后多糖清除·OH的能力下降,且分子量越低清除能力越差；代瓊等人[8]研究發(fā)現(xiàn)分子量為10～80ku之間的LMWHA清除·OH的能力最強,當分子量小于10ku時,清除能力反而有所下降,但仍遠大于降解前的HA。目前認為,透明質(zhì)酸清除羥自由基的方式有兩種[20]:一種是直接清除·OH,透明質(zhì)酸分子鏈上存在大量的氫原子,其能與自由基結合生成水,通過對HA的結構進行分析可知,降解前后HA的基本結構未發(fā)生變化,可能并不影響HA鏈上的氫原子和·OH的結合；另一種是螯合產(chǎn)生·OH反應中所必須的過渡金屬,如Fe3+、Cu2+,使得自由基反應中斷,HA螯合金屬離子的能力和其分子量大小沒有直接的關系[21-22]。

圖4 不同分子量LMWHA對羥自由基的清除效果Fig.4 ·OH radical scavenging activity of LMWHA with different molecular weight

2.7 不同分子量透明質(zhì)酸還原力效果的比較

3 總結

利用微波結合過氧化氫+抗壞血酸法降解羅非魚眼透明質(zhì)酸,通過改變HA降解時溶液的pH、過氧化氫的加入量以及H2O2∶VC制備相對分子量分別為小于5、5～10、10～30、30～60ku的LMWHA1、LMWHA2、LMWHA3、LMWHA4,并利用紅外光譜、紫外光譜對其結構進行分析,降解前后HA的紅外光譜基本一致,說明降解未對HA的基本結構造成影響,降解前后HA的紫外光譜稍有變化,LMWHA在260nm處均出現(xiàn)不同程度的吸收,分子量越小吸收越大,說明降解對HA的微結構造成了影響,這可能源于降解時主鏈斷裂或者脫氫反應產(chǎn)生的不飽和結構。

本文通過研究LMWHA對·OH、DPPH·的清除率以及還原力來考察LMWHA的抗氧化能力。結果顯示,隨著LMWHA分子量的減小其對DPPH·的清除率以及還原力增大,而對·OH的清除率減小,這可能與LMWHA和自由基的作用機理有關,LMWHA清除DPPH·以及還原力的大小依賴于其雙鍵的數(shù)量,而清除·OH能力大的大小則依賴于LMWHA鏈上羥基以及其螯合過渡金屬離子的能力。以上只是對透明質(zhì)酸抗氧化性及其機理的初步探討,還需要進一步的科學研究。

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Preparation and antioxidant properties oflow molecular weigh hyaluronic acid from tilapia eye

GAO Rui-chang1,CHEN Hui1,2,LI Lai-hao2,YU Gang2,WU Yan-yan2,HU Xiao2,CHEN Sheng-jun2，*

(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China；2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center forAquatic Product Processing;South China Sea Fisheries Research Institute,CAFS,Guangzhou 510300,China)

LMWHA with relative molecular weight less than 5,5～10,10～30,30～60ku were prepared by changing the degradation conditions of the microwave combined with hydrogen peroxide and ascorbic acid. Reducing power,scavenging ability on ·OH and DPPH free radical of different molecular weight LMWHA were determined. Results showed that the scavenging ability of DPPH free radical and reducing power increased with molecular weight decreased,while the scavenging ability of ·OH decreased,this phenomenon may be associated with the mechanism of LMWHA removing free radicals,the scavenging ability of DPPH and reducing power of LMWHA depended on the number of the double bonds,but the scavenging ability of ·OH depended on the Hydroxyl groups of LMWHA and the ability of chelating transition metal ions. Therefore,low molecular weight hyaluronic acid had good oxidation resistance.

tilapia eyes;hyaluronic acid;degradation;antioxidation

2014-03-24

高瑞昌(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品化學與綜合利用。

*通訊作者:陳勝軍(1973-)，男，博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制研究。

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所)資助項目(2013TS01)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-49)；江蘇大學“青年骨干教師培養(yǎng)工程”。

TS254.9

A

1002-0306(2015)03-0060-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.003