董耀華，賀中意，郭 娜，劉 濤，董麗華

(上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

海洋微生物在船舶用結(jié)構(gòu)鋼表面附著成膜過程及其腐蝕研究

董耀華，賀中意，郭 娜，劉 濤，董麗華*

(上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定了海洋微生物需鈉弧菌Vibrionatriegens的生長曲線，通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測(cè)了該細(xì)菌在船舶用結(jié)構(gòu)鋼(DH32)鋼樣表面成膜過程及試樣腐蝕形貌，探討了生物膜的形成過程及其對(duì)材料表面腐蝕的影響。結(jié)果表明，生物膜的形成過程與微生物生命活動(dòng)關(guān)系密切。根據(jù)對(duì)比暴露在菌液和無菌培養(yǎng)基中的試樣表面形貌，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的附著及成膜過程的不均勻性，改變了DH32鋼樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)。細(xì)菌附著區(qū)與周圍形成的氧濃差電池，以及細(xì)菌新陳代謝主要產(chǎn)物對(duì)金屬離子的絡(luò)合，共同促進(jìn)了試樣局部腐蝕加速。

海洋微生物；生物膜；腐蝕

0 引言

海洋船舶用結(jié)構(gòu)鋼作為最常見的涉海材料之一，主要包括高強(qiáng)鋼AH32、DH32、AH36和DH36等，厚度在12～30 mm之間，這類船舶用鋼強(qiáng)度高，但耐海洋環(huán)境生物腐蝕的性能卻比較差。海洋微生物活性所引起的微生物腐蝕(microbially-influenced corrosion, MIC)已經(jīng)被公認(rèn)為是船舶及海洋工程用結(jié)構(gòu)鋼腐蝕破壞的重要形式[1-3]。在海洋環(huán)境中服役的船舶，由海洋污損導(dǎo)致的燃油消耗增加可達(dá)40%，航次總成本增加可達(dá)77%，而且每年僅用于全球船只防污劑美觀工藝的花費(fèi)約有7億美元，此外更為嚴(yán)重的是，船舶海水冷卻管道和諸如船舶壓載艙等各種液體艙的微生物腐蝕破壞也極大地影響船舶壽命及安全性[4-5]。

大量的實(shí)驗(yàn)表明，在海洋環(huán)境中，與金屬直接接觸的腐蝕介質(zhì)并非海水而是微生物，所以可以肯定船舶用鋼腐蝕破壞的重要發(fā)生因素是微生物通過在材料表面附著及形成的生物膜與其發(fā)生相互作用，使得材料表面始終處于非穩(wěn)定狀態(tài)，直接或間接參與和影響了金屬的腐蝕過程[6]，從而導(dǎo)致金屬性能的劣化和破壞。MIC是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物和化學(xué)過程，目前有關(guān)MIC的研究層出不窮，例如REMAZEILLES et al[7]認(rèn)為，微生物膜對(duì)陰極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響可能導(dǎo)致腐蝕電位的正移，同時(shí)微生物膜內(nèi)形成的氧濃差電池和陰極反應(yīng)速度的增加使得天然海水比無菌海水更具腐蝕性。JAVAHERDASHTI et al[8]認(rèn)為，金屬表面的酸化和微生物膜內(nèi)的過氧化氫的產(chǎn)生是導(dǎo)致材料腐蝕電位正移的原因。BEECH[9]研究了腐化海水環(huán)境中碳鋼的腐蝕行為，提出微生物膜內(nèi)硫酸鹽還原菌(SRB)的存在是加速材料腐蝕的主要原因，他認(rèn)為SRB釋放的硫化氫導(dǎo)致膜內(nèi)pH值下降，加速了陽極溶解。OSIRO et al[10]也證實(shí)了相關(guān)的結(jié)論，同時(shí)提出微生物膜內(nèi)特殊酶的作用也是影響材料腐蝕行為的主要因素之一。趙軍 等[11]卻認(rèn)為微生物胞外分泌物(EPS)是影響材料腐蝕行為的主要原因。此外，也有大量學(xué)者認(rèn)為微生物膜的形成可以阻礙溶解氧的擴(kuò)散或分泌某種具有緩蝕作用的物質(zhì)，從而抑制材料腐蝕，起到保護(hù)材料的作用[12-15]。由此可見，目前大部分研究主要著眼于生物膜對(duì)金屬腐蝕的影響及機(jī)制，很少去分析生物膜形成的過程，而事實(shí)上，微生物的附著過程對(duì)船舶用鋼的耐海洋微生物腐蝕研究卻至關(guān)重要[7]。本文以DH32鋼為研究對(duì)象，以海洋環(huán)境中普遍存在的需鈉弧菌Vibrionatriegens為實(shí)驗(yàn)菌種，使用紫外分光光度計(jì)(UV-Vis，PerkinElmer，Lambda35)、電子掃面顯微鏡(SEM，JEOL，JSM7500F)和原子力顯微鏡(AFM，Bruke，Dimension ICON)等測(cè)定了V.natriegens的生長曲線，探討了其在DH32鋼樣表面的附著過程以及對(duì)試樣腐蝕行為的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料和試樣

實(shí)驗(yàn)材料為碳鋼DH32，其主要合金成分為：Fe 96.79%，C 0.056%，Mn 1.496%，Cu 0.198%， Al 0.037 5%，Ni 0.662%，Cr 0.183%，Si 0.191%和P 0.008 5%。實(shí)驗(yàn)前，將DH32鋼板用線切割機(jī)切成一批尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的鋼樣，將其任意10 mm×10 mm的一面選擇為工作面，非工作面用焊接導(dǎo)線，并用環(huán)氧樹脂封裝，工作面并經(jīng)300#、600#、800#和1 200# 耐水SiC砂紙依此打磨，然后用0.3 μm氧化鋁粉末進(jìn)行拋光處理，丙酮超聲除油，最后用乙醇沖洗、自然干燥待用。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及生長曲線測(cè)定

需鈉弧菌采用淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其成分為：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L和可溶性淀粉2 g/L。

生長曲線通過比濁法測(cè)定。具體步驟如下：用移液槍吸取0.01 mL過夜V.natriegens菌液，加入到100 mL無菌培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分為：1 L 過濾后的無菌海水、10 mg/L FePO4、5 g/L蛋白胨和1 g/L 酵母汁)，然后放置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)時(shí)間，每次取出0.5 mL與4.5 mL無菌培養(yǎng)基混合均勻后用紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis，Lambda 35)測(cè)定在600 nm下的O.D600 nm值。實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，結(jié)果取3次測(cè)量的平均值。

1.3 微生物在金屬表面附著成膜過程觀測(cè)

將準(zhǔn)備好的DH32試樣依此用尼龍繩懸掛放入新培養(yǎng)的需鈉弧菌培養(yǎng)液中，每7 d更換一半的培養(yǎng)基。按照實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)時(shí)間間隔依此將試樣取出，并用PBS緩沖液緩慢沖洗工作表面，然后將試樣置于100 mL含2%戊二醛的PBS溶液中固化5～8 h，取出后，依此用體積分?jǐn)?shù)分別為25%，50%，75%和100%的乙醇逐級(jí)脫水，然后低溫干燥[8]。利用SEM(Japan, JEOL , JSM7500)在5.0 kV工作電壓下對(duì)其表面進(jìn)行掃描電鏡觀察，同時(shí)采用能譜儀(EDS)進(jìn)行材料表面元素種類分析及含量測(cè)定。

1.4 材料表面腐蝕微觀形貌

刮取試樣表面的生物膜和腐蝕產(chǎn)物，乙醇逐級(jí)脫水，低溫干燥后，再次使用原子力顯微鏡(AFM，Dimension ICON)在輕敲模式下作表面觀察。實(shí)驗(yàn)以無菌培養(yǎng)基作對(duì)照，試樣處理方法與有菌培養(yǎng)基處理方法相同。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌生長曲線

根據(jù)比濁法，使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定菌液透光度，再據(jù)其與菌液中細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系，得到細(xì)菌的生長曲線，如圖1所示。

圖1 需鈉弧菌的生長曲線

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，V.natriegens的生長過程大致可以分為4個(gè)階段：最初的1個(gè)階段為生長延滯期，出現(xiàn)在需鈉弧菌擴(kuò)培的第1天，這段時(shí)間由于培養(yǎng)基成分和生長環(huán)境的變化等因素，影響了需鈉弧菌生長，具體表現(xiàn)為盡管需鈉弧菌形態(tài)開始變大或增長，細(xì)胞合成代謝十分活躍，核糖體和酶類等合成加速，胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量也在增高，原生質(zhì)呈嗜堿性，變得均勻，但需鈉弧菌暫時(shí)停滯生長，數(shù)量增長速率常數(shù)為零。第2個(gè)階段為生長指數(shù)期，或者稱生長對(duì)數(shù)期，出現(xiàn)在擴(kuò)陪的第2天至第3天，這段時(shí)間里，需鈉弧菌代謝旺盛，酶系活躍，細(xì)菌數(shù)量以幾何級(jí)數(shù)快速增長，并在3 d后達(dá)到最大值。第3個(gè)階段為穩(wěn)定期，出現(xiàn)在生長指數(shù)期的隨后1 d左右時(shí)間內(nèi)，特點(diǎn)是需鈉弧菌數(shù)量大致恒定，即處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)量與衰亡的細(xì)胞數(shù)量相等的動(dòng)態(tài)平衡中，這時(shí)的需鈉弧菌產(chǎn)量達(dá)到了制高點(diǎn)，菌體的產(chǎn)量與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗呈現(xiàn)規(guī)律比例關(guān)系。從第5天開始，需鈉弧菌進(jìn)入第4個(gè)階段，即衰亡期，此時(shí)，外界環(huán)境對(duì)需鈉弧菌生長越來越不利，細(xì)胞形態(tài)相繼發(fā)生變化，甚至因蛋白水解酶活力的增加而發(fā)生自溶現(xiàn)象，細(xì)菌大量死亡，個(gè)體死亡速率超過新生速度，培養(yǎng)基中呈現(xiàn)細(xì)菌負(fù)生長狀態(tài)。

2.2 微生物在金屬表面附著成膜過程分析

需鈉弧菌是一種在海洋環(huán)境普遍存在的固氮類細(xì)菌，并且是世界上繁殖速度最快的細(xì)菌之一，極易在材料表面形成生物膜[3]。圖2是DH32試樣懸掛于需鈉弧菌的培養(yǎng)基中不同時(shí)期的表面細(xì)菌附著形貌SEM照片。從圖中可以看出，試樣浸泡1 d后，原本光滑的表面上附著了一些零星的細(xì)菌個(gè)體和少量的腐蝕產(chǎn)物；浸泡3 d后，試樣表面開始形成分布不均的菌落，細(xì)菌顯著變多，并呈鏈狀排列；浸泡5 d后，可以觀察到明顯的細(xì)菌新陳代謝產(chǎn)物，即EPS。之后，隨著時(shí)間的推移，試樣表面附著的細(xì)菌越來越多，菌落也逐漸變大，試樣可見面積越來越小，42 d后，試樣表面被一層致密的微生物膜完全覆蓋。

結(jié)合需鈉弧菌生長曲線的測(cè)定結(jié)果可知，在試樣浸泡初期，細(xì)菌處于生長延滯期，培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量不多，所以只有零星的細(xì)菌以個(gè)體形式附著在試樣表面，而這種附著過程，可能是因?yàn)樵嚇臃湃肱囵B(yǎng)基后，表面會(huì)吸附一些溶解態(tài)的有機(jī)物或無機(jī)物，改變了材料表面的電荷電性或憎水性等特征，使得具有類似膠體表面的細(xì)菌被吸附到了材料表面。之后隨著對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，細(xì)菌進(jìn)入生長指數(shù)期，開始大量繁殖，吸附在試樣表面的細(xì)菌也開始形成菌落，胞外分泌物開始變多。這種分泌物可以部分解釋細(xì)菌黏附到材料表面的原因，因?yàn)樗梢詭椭⑸锞o緊地吸附在材料的表面。在接下來的時(shí)間里，材料表面的菌落越來越多，這一方面是由于細(xì)菌的附著使得材料表面狀態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)菌的附著變得越來越容易，另一方面是已經(jīng)附著的細(xì)菌也在材料表面繼續(xù)繁殖，這個(gè)過程中，生物膜逐漸形成，而且越來越厚，里面不僅僅是活的細(xì)菌，還包括它們新陳代謝的產(chǎn)物和衰亡的細(xì)菌，這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得材料與微生物之間形成了一種半生命、半活性的特殊復(fù)合界面結(jié)構(gòu)。

圖2 DH32試樣在菌液中浸泡不同時(shí)間后表面細(xì)菌 附著的SEM形貌

圖3是DH32試樣在菌液中浸泡不同時(shí)間后，表面的EDS譜圖。由圖可見，浸泡1 d后，試樣表面的主要化學(xué)元素為Fe、C、Mn和少量的P(圖3a)。浸泡7 d后(圖3b)，試樣表面檢測(cè)出O、N和Na等元素，而且P和C元素含量成倍增長。21 d后(圖3c)，P和O元素含量持續(xù)增長，而且檢測(cè)出S元素的存在。此外，從檢測(cè)結(jié)果看來，F(xiàn)e元素含量隨時(shí)間推移持續(xù)減少。

圖3 試樣在菌液中浸泡1 d(a)、7 d(b)和 21 d(c)后表面EDS能譜圖

元素Fe、C和Mn是DH32冶煉中的主要成分，元素P、O、N和S是微生物生命活動(dòng)必不可少的生命元素。第1天少量P元素的出現(xiàn)，說明試樣表面有少量細(xì)菌附著，但因沒有檢測(cè)出O元素，所以可以判斷，此時(shí)試樣幾乎沒有受到培養(yǎng)基和細(xì)菌的影響，這與SEM觀察到的結(jié)果基本一致。隨后的20 d內(nèi)，N和S元素依次出現(xiàn)，P和O元素持續(xù)增多，這些生命元素的變化，說明材料表面的生物膜逐漸形成，同時(shí)從Fe元素含量逐漸降低的趨勢(shì)來看，微生物膜隨時(shí)間推移越來越致密，使得試樣表面的Fe元素越來越難被檢測(cè)到。

2.3 表面腐蝕微觀形貌

為了直觀地了解微生物附著過程對(duì)材料腐蝕的影響，使用無菌培養(yǎng)基浸泡試樣作為對(duì)照，比較兩種情況下，試樣的腐蝕程度。圖4a和圖4c分別為試樣暴露在菌液中3 d和42 d后的表面AFM腐蝕形貌圖，圖4b和圖4d為試樣暴露在無菌海水中3 d和42 d后的表面AFM腐蝕形貌圖。從圖中可以看出，前3 d內(nèi)，浸泡在兩種腐蝕介質(zhì)中的試樣表面粗糙度較小，且沒有顯著區(qū)別，這說明浸泡初期，細(xì)菌生長延滯，新陳代謝活性不高，試樣表面附著的細(xì)菌也不多，試樣的腐蝕以海水腐蝕為主，細(xì)菌對(duì)試樣腐蝕行為的影響不大。但在隨后的觀察中可以發(fā)現(xiàn)，浸泡在菌液中42 d后的試樣，其表面粗糙不堪，其局部腐蝕程度明顯大于對(duì)照樣。這說明，微生物的附著和繁殖過程，改變了試樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)，影響了材料腐蝕行為，并在局部起到劇烈加速材料腐蝕的作用。

由于需鈉弧菌是一種需氧細(xì)菌，其新陳代謝活動(dòng)需要消耗氧氣[3]。在需鈉弧菌附著的過程中，菌落的形成和分布并不均勻，所以其局部的耗氧活動(dòng)無疑會(huì)導(dǎo)致試樣表面細(xì)菌附著區(qū)局部溶解氧的降低，而周圍區(qū)域氧含量較高，進(jìn)而造成試樣表面富氧區(qū)和貧氧區(qū)的分化，使局部形成氧濃差電池，貧氧區(qū)形成陽極，周圍成為陰極，從而加速材料局部腐蝕。盡管部分研究者認(rèn)為微生物的生命活動(dòng)可以改變環(huán)境pH值，進(jìn)而影響材料腐蝕行為[16]，但從圖4c中明顯的不均勻腐蝕形貌來看，氧氣濃度的變化對(duì)金屬腐蝕的影響要大于pH值變化的影響，氧氣對(duì)陰極的去極化作用可以使材料加速腐蝕。造成試樣在微生物附著成膜過程中加速腐蝕的另外一個(gè)原因可能也和細(xì)菌新陳代謝產(chǎn)物EPS有關(guān)。EPS主要由蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂類等高分子物質(zhì)組成，其中含有大量的諸如羥基、羧基、磷酸根、硫酸根、甘油酸根、丙酮酸根和琥珀酸根等帶負(fù)電的官能團(tuán)[17-18]。這些官能團(tuán)有一個(gè)重要的特點(diǎn)，即能與帶正電荷的金屬離子，如Fe3+、Mn2+和Cu2+等結(jié)合發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而作為電子運(yùn)輸器，在微生物膜和金屬基體之間開啟新的氧化還原反應(yīng)途徑，導(dǎo)致電子從基體向受體的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)試樣陽極溶解，加速材料腐蝕。

圖4 試樣浸泡在菌液(a、c)和無菌培養(yǎng)基(b、d)中不同時(shí)間后的AFM圖

3 結(jié)論

本文通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定了海洋微生物需鈉弧菌的生長曲線，通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測(cè)了該細(xì)菌在船舶用結(jié)構(gòu)鋼(DH32)鋼樣表面成膜過程及試樣腐蝕形貌，結(jié)果表明生物膜的形成與微生物生命活動(dòng)關(guān)系密切。在生長初期，細(xì)菌新陳代謝活性不高，試樣表面附著的細(xì)菌也不多，試樣的腐蝕以海水腐蝕為主，細(xì)菌對(duì)試樣腐蝕行為的影響不大。但隨時(shí)間推移,細(xì)菌大量繁殖，在試樣表面形成分布不均的大小菌落，并逐漸形成一層致密的生物膜。在微生物膜的形成過程中，因?yàn)榫浞植疾痪约凹?xì)菌新陳代謝產(chǎn)物EPS對(duì)材料表面金屬離子的絡(luò)合，改變了試樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)，影響了材料腐蝕行為，并加速了材料的局部腐蝕速度。

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The formation process of biofilm of marine microorganism and the influence on the corrosion of the ship structural steel

DONG Yao-hua， HE Zhong-yi， GUO Na， LIU Tao， DONG Li-hua*

(TheInstituteforMarineMaterialsScienceandEngineering，ShanghaiMaritimeUniversity，Shanghai201306，China)

In order to study the influence of the formation of biofilm on the corrosion of DH32 structural steel, the growth curve of a marine microorganism (Vibrionatriegens) was tested by UV-Vis spectra, the formation process of biofilm and the surface of the coupons were characterized by scanning electron microscope and atomic force microscope, respectively. The results show that the formation of biofilm closely associates with the growth of bacteria, the formation process of biofilm changes the chemical and physical state of the steel surface. Moreover, the formation of oxygen concentration cell and binding power of extracellular polymeric substances with metal ions greatly promotes the DH32 surface oxidation corrosion.

marine microorganism; biofilm; corrosion

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006.

2014-10-24

2014-12-10

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助(2014CB643306)；上海自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(14ZR1419800)

董耀華(1983-)，男，湖北潛江市人，博士，講師，主要從事海洋與船舶工程方面的研究。E-mail：yhdong@shmtu.edu.cn

*通訊作者:董麗華(1964-)，女,教授，主要從事海洋與船舶工程方面的研究。E-mail：lhdong@shmtu.edu.cn

X17

A

1001-909X(2015)01-0039-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006

董耀華，賀中意，郭娜，等.海洋微生物在船舶用結(jié)構(gòu)鋼表面附著成膜過程及其腐蝕研究[J].海洋學(xué)研究,2015,33(1):39-44,

DONG Yao-hua，HE Zhong-yi，GUO Na, et al. The formation process of biofilm of marine microorganism and the influence on the corrosion of the ship structural steel[J]. Journal of Marine Sciences,2015,33(1):39-44, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006.