徐軼爾 孫貴才 鄭春雨 吳洪亮 劉明海 凌小鵬 孫步蟾 涂遠(yuǎn)青 樊祥偉

【摘 要】目的：研究豨薟草對(duì)尿酸鈉引起的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞炎性因子的作用機(jī)制。方法：選取健康清潔級(jí)10～13周齡雄性Wistar大鼠108只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、薟草高劑量組、薟草中劑量組、薟草低劑量組、秋水仙堿組，每組18只。除空白對(duì)照組外，其余各組均通過(guò)尿酸鈉致大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，用薟草不同劑量和秋水仙堿對(duì)模型大鼠灌胃給藥。觀察各組大鼠關(guān)節(jié)組織的病理學(xué)變化和測(cè)定白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)。結(jié)果：模型對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)紅腫明顯且不敢發(fā)力，腫脹關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、TNF-α、NF-κB水平顯著升高，滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，排列紊亂，成纖維細(xì)胞增生，組織壞死并且炎性滲出。薟草高、中劑量組治療效果明顯，紅腫減弱，薟草高劑量組周?chē)浗M織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)并不明顯，腫脹關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、TNF-α、NF-κB均顯著降低。結(jié)論：薟草通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α、NF-κB表達(dá)，可有效抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎局部的炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;豨薟草;尿酸鈉;IL-1β;TNF-α;NF-κB;大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.01.002

Effects of Xixiancao on the Expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB of Gouty Arthritis Caused by Sodium Urate

XU Yi-er，SUN Gui-cai，ZHENG Chun-yu，WU Hong-liang，LIU Ming-hai，LING Xiao-peng，SUN Bu-chan，

TU Yuan-qing，F(xiàn)AN Xiang-wei

【ABSTRACT】Objective：To research the mechanism of action of Xixiancao[Herba Siegesbeckiae]to the cell inflammatory factor of gouty arthritis induced by sodium urate.Methods： 108 Wistar male rats of clean grade 10-13 weeks were randomly divided into blank control group，model control group，Xixiancao high dose group，Xixiancao middle dose group group，Xixiancao low dose group and colchicine group，18 rats in each group.Except for the blank control group，the other groups by gouty arthritis rat model induced by sodium urate.The models were given different dosage of Xixiancao and colchicine by intragastric administration，observing their pathological changes of articular tissue and measuring the expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB.Results：The rats in the model control group had knee joint swelling obviously and couldnt move with force.The level of IL-1β，

TNF-α and NF-κB in the leachate form the swollen joints significantly increased.There were synovial cell hyperplasia，inflammatory cell infiltration，arrangement in disorder，fibroblast proliferation，tissue necrosis and inflammatory exudation.The therapeutic effect of the high and middle dose groups of Xixiancao was obvious and red swelling weakened.The phlogocyte infiltration in surrounding soft tissue of the high dose group of Xixiancao was not obvious and IL-1β，

TNF-α ?and NF-κB in the leachate form the swollen joints significantly decreased.Conclusion：By the expression of IL-1β，TNF-α and NF-κB，Xixiancao could effectively inhibit the local inflammatory reaction of gouty arthritis.

【Keywords】 gouty arthritis;Xixiancao;sodium urate;IL-1β;TNF-α;NF-κB;rat

痛風(fēng)（gout）是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過(guò)多或排泄減少，造成血尿酸水平增高，尿酸鹽結(jié)晶在體內(nèi)沉積所致的一組異質(zhì)性疾病。其臨床表現(xiàn)為由高尿酸血癥、尿酸鹽沉積所導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的急、慢性關(guān)節(jié)炎和軟組織損傷[1]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方薟草膠囊治療急性痛風(fēng)，抗炎鎮(zhèn)痛作用快、藥效強(qiáng)、副作用小，其發(fā)揮抗炎的機(jī)制可能是抑制滑膜細(xì)胞IL-1β和IL-8的合成，進(jìn)而抑制前列腺素等其他炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[2]。而作為復(fù)方薟草膠囊的君藥，薟草如何發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察尿酸鈉致大鼠關(guān)節(jié)炎滑膜，研究薟草對(duì)IL-1β、TNF-α、NF-κB的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)10～13周齡雄性Wistar大鼠108只，體質(zhì)量200～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2008004，Wistar大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫22～24 ℃，飼養(yǎng)2周，自由飲食、飲水和自然光照。

1.2 藥品與試劑 薟草（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供）經(jīng)浸泡后煎煮成湯劑，每毫升藥液中含有生藥3.6 g。薟草低、中、高劑量組的給藥劑量分別為18，36，72 g·kg-1·d-1，秋水仙堿組給藥劑量為0.03 mg·kg-1·d-1，秋水仙堿片由云南制藥有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水按0.003 mg·mL-1配成懸濁液，每次使用時(shí)注意渦旋混合。RNA提取試劑，Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑，AccuPowerR RocketScriptTM RT Premix（韓國(guó)Bioneer公司）;PCR反應(yīng)試劑，2x Es Taq MasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.3 儀 器 超凈工作臺(tái)，Sw-GJ-IF型（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;倒置顯微照相系統(tǒng)（日本OLMPUS公司）;倒置顯微鏡，DMIRB型（德國(guó)LEICA公司）;XJ-70型電子分析天平DF-110型（常熟衡器工業(yè)公司）;PCR儀（杭州博日科技LifeExpress PCR擴(kuò)增儀）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 尿酸鈉所致大鼠急性關(guān)節(jié)炎模型建立 取戊巴比妥鈉適量，精密稱(chēng)量用生理鹽水溶解，配制成2%濃度的戊巴比妥鈉溶液，腹腔注射戊巴比妥鈉0.2 mL·100 g-1，按Coderre等經(jīng)典方法略作改進(jìn)制作模型。固定大鼠后，清理干凈膝關(guān)節(jié)部位皮毛，在大鼠膝關(guān)節(jié)表皮成乳白色處用6號(hào)注射器刺入，感覺(jué)有突破感后注入尿酸鈉懸濁液。大鼠單側(cè)踝關(guān)節(jié)注入足夠量的單鈉尿酸鹽（MSU）晶體可迅速誘導(dǎo)急性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎發(fā)生率為100%[2]。

每個(gè)關(guān)節(jié)0.2 mL尿酸鈉懸濁液，相應(yīng)的空白對(duì)照組注射等劑量的生理鹽水。

2.1.2 分組 將Wistar大鼠108只飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、薟草高劑量組、薟草中劑量組、薟草低劑量組、秋水仙堿組，每組18只。實(shí)驗(yàn)中，均開(kāi)架分籠飼養(yǎng)，自由攝食，自然光照，并定期清潔、消毒。

2.1.3 給藥方法 空白對(duì)照組給予每天灌胃生理鹽水2 mL，第4天用0.2 mL生理鹽水注射大鼠膝關(guān)節(jié)，然后再灌胃3 d。模型對(duì)照組給予每天每只灌胃2 mL生理鹽水作為安慰劑，第4天用尿酸鈉溶液造模，然后再灌胃3 d。秋水仙堿組給予每天每只灌胃2 mL秋水仙堿混懸液，第4天用尿酸鈉溶液造模，然后再灌胃3 d。薟草低劑量組給予每天灌胃薟草混懸液18 g·kg-1，第4天用尿酸鈉溶液造模，然后再灌胃3 d。薟草中劑量組給予每天灌胃薟草混懸液36 g·kg-1，第4天用尿酸鈉溶液造模，然后再灌胃3 d。薟草高劑量組給予每天灌胃薟草混懸液72 g·kg-1，第4天用尿酸鈉溶液造模，然后再灌胃3 d。

2.1.4 HE染色 標(biāo)本固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi)，用4%的鹽酸水溶液脫鈣后使用梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋：切片厚度4 μm，置于用防脫片劑處理過(guò)的干凈玻片上，60%恒溫箱中烤片4 h：石蠟切片脫蠟至水，蘇木素浸染10 min，

流水沖洗切片1 min，0.5%～1%鹽酸酒精分化

3～5 s（顏色由藍(lán)變紅），自來(lái)水沖冼6 min以上，

l%伊紅酒精浸染3～5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.1.5 RT-PCR檢測(cè)滑膜細(xì)胞因子的表達(dá) 灌胃

3 d后將大鼠脫臼處死，于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見(jiàn)平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織。用PBS洗滌

1遍后立即轉(zhuǎn)入組織勻漿器研磨，以1 mL TRIzol抽提總RNA。檢測(cè)獲得的RNA量和純度后以20 μL

體系將3 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板20 μL，用于PCR檢測(cè)。所用引物序列大小和PCR條件。見(jiàn)表1。反應(yīng)程式為94 ℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性45 s，不同溫度下退火30 s，72 ℃延伸

1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸5 min，降至4 ℃。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳并成像分析，以ImageJ軟件（NIH）對(duì)產(chǎn)物條帶光密度值進(jìn)行計(jì)算。IL-1β、TNF-α、NF-κB與β-actin比值代表目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)含量。

2.1.6 IL-1β、TNF-α、NF-κB的測(cè)定 取出滑膜組織步驟同2.1.5，分別測(cè)定IL-1β、TNF-α、NF-κB，

按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

2.1.7 腫脹指數(shù)測(cè)定 通過(guò)2～3 mm寬紙條和游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)前和造模后不同時(shí)間的關(guān)節(jié)周徑，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=（測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑-初始周徑）/

初始周徑。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以表示，采用方差分析和Tukey檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組造模后不同時(shí)間腫脹度比較 造模后3 d內(nèi)各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度均有所增高，灌胃治療后第3天，薟草中高劑量組和秋水仙堿組腫脹度均明顯低于模型對(duì)照組。見(jiàn)表2。

3.2 薟草對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中IL-1β、

TNF-α和NF-κB表達(dá)的影響 模型對(duì)照組大鼠滑膜中IL-1β、TNF-α和NF-κB炎性因子表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，秋水仙堿組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL-1β、

TNF-α和NF-κB表達(dá)量明顯低于模型對(duì)照組，薟草高、中、低劑量組滑膜中IL-1β、TNF-α和NF-κB表達(dá)量與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05），同時(shí)隨著薟草劑量的增加，IL-1β、TNF-α和NF-κB表達(dá)量逐漸減低。見(jiàn)圖1。IL-1β、TNF-α、NF-κB與β-actin光密度比值掃描值見(jiàn)表3。

3.3 薟草對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠病理學(xué)改變的影響 空白對(duì)照組大鼠周?chē)浗M織、關(guān)節(jié)、滑膜及軟骨細(xì)胞正常。模型對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)紅腫明顯且不敢發(fā)力，滑膜有尿酸鹽結(jié)晶沉積并且大鼠滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，排列紊亂，成纖維細(xì)胞增生，組織壞死并且炎性滲出，較好地模擬了人急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病變特點(diǎn)。秋水仙堿組大鼠療效也十分顯著，但大鼠生理狀態(tài)不佳，大鼠糞便偏稀，活動(dòng)明顯減少，毛發(fā)枯亂無(wú)光澤極易掉落，體重下降，滑膜組織有壞死、炎性滲出、仍有少量尿酸鹽結(jié)晶，但明顯減少，滑膜組織仍見(jiàn)有炎性的壞死灶，周?chē)p度水腫。薟草高、中劑量組治療效果明顯，大鼠爬行時(shí)雙膝敢于發(fā)力且紅腫減弱，薟草高劑量組周?chē)浗M織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)并不明顯，薟草低劑量組大鼠關(guān)節(jié)處紅腫減弱不明顯，雙膝不能發(fā)力，薟草中、低劑量組滑膜組織中仍有尿酸鹽的結(jié)晶，滑膜組織仍明顯水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

3.4 各組滑膜組織的TNF-α和IL-1β含量 酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)測(cè)定各組大鼠（每組選擇8只大鼠）滑膜組織中TNF-α和IL-1β的含量。結(jié)果顯示，模型對(duì)照組滑膜組織中的TNF-α和IL-1β明顯高于空白對(duì)照組，薟草高、中、低劑量組與秋水仙堿組滑膜組織中的TNF-α和IL-1β表達(dá)量明顯低于模型對(duì)照組。表明薟草和秋水仙堿能夠明顯降低滑膜組織中TNF-α和IL-1β炎性因子的表達(dá)量，隨著薟草給藥劑量的增加，對(duì)滑膜組織中的TNF-α和IL-1β抑制作用逐漸增大。見(jiàn)表4。

4 討 論

長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙引起血尿酸升高，使痛風(fēng)在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率逐年升高[4]，降低高尿酸血癥是治療痛風(fēng)的必要條件，阻止尿酸鈉結(jié)晶在關(guān)節(jié)及其周?chē)俜e可減少痛風(fēng)的發(fā)作[5]。尿酸鈉晶體能引起炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，同時(shí)引起滑膜細(xì)胞與炎癥細(xì)胞、滑膜細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，造成滑膜增生[6]。

有學(xué)者認(rèn)為，MSU可直接刺激滑液中單核細(xì)胞導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)生，由于TNF-α可能增強(qiáng)多形核白細(xì)胞的活性而使IL-1β釋放，所以TNF-α在結(jié)晶沉積病中發(fā)揮重要作用。西藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎雖然能迅速緩解癥狀，但其明顯的不良反應(yīng)限制了臨床應(yīng)用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)乃本虛標(biāo)實(shí)之證，脾腎雙虧為本，濕、熱、痰、濁、毒凝滯為標(biāo)。薟草具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效，但是作用機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)選擇TNF-α與NF-κB作為切入點(diǎn)，是因?yàn)門(mén)NF-α被認(rèn)為是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)鏈中的第1個(gè)細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子，TNF-α表達(dá)升高導(dǎo)致包括IL-1β、單核細(xì)胞刺激因子表達(dá)升高，而IL-1β又能提高TNF-α的活性，進(jìn)而炎癥加重。NF-κB在細(xì)胞中通常和抑制因子IκB結(jié)合，以非活性的狀態(tài)存在，接受TNF-α的刺激后，進(jìn)入核內(nèi)起始轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化，再由IKKβ刺激IkBα磷酸化進(jìn)而最終激活了NF-κB[7-8]。實(shí)驗(yàn)研究證明了TNF-α能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，這與TNF-α在關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞中的作用密切相關(guān)[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薟草能降低TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是受TNF-α調(diào)節(jié)的分子，進(jìn)而NF-κB mRNA的表達(dá)減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薟草可以抑制TNF-α誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄，從而減少I(mǎi)L-1β表達(dá)來(lái)減輕局部炎癥反應(yīng)，最終抑制急性痛風(fēng)的病程發(fā)展，這可能是薟草發(fā)揮治療急性痛風(fēng)的機(jī)制之一。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 吳東海.痛風(fēng)和高尿酸血癥[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2008，2（6）：723.

[2] 孫貴才，于學(xué)峰，李登宇.復(fù)方豨薟草膠囊對(duì)尿酸鈉致大鼠關(guān)節(jié)炎滑膜IL-1β、IL-8含量的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2（6）：329-331.

[3] 黃火高，孫運(yùn)峰，胡明，等.大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立及特點(diǎn)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29（6）：538-542.

[4] 陳光亮，段玉光，李莉，等.加味四妙湯對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎防治作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（3）：48-52.

[5] Punzi L，Scanu A，Ramonda R，et al.Gout as autoinflammatory disease：new mechanisms for more appropriated treatment targets[J].Autoimmun Rev，2012，12（1）：66-71.

[6] 王仁嬡，吳萍，楊艷，等.桑當(dāng)對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織ICAM-1與NF-κB表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（15）：257-259.

[7] Terkeltaub R.Pathogenesis and treatment of crysta-l induced inflammation.In：Koopman WJ.editor.Arthritis and allied conditions：atextbook ofrheumatology[J].Baltimore：Williams and Wilkins，1996（10）：2085.

[8] Rothe M，Sarma V，Dixit VM，et al.TRAF2-mediated activationof NF-kappa B by TNF receptor 2 and CD40[J].Science，1995，269（5229）：1424-1427.

[9] 羅心靜，莫選榮，周玲玲.TNF-α誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路活化的探討[J].免疫學(xué)雜志，2012，28（4）：321-323，332.

收稿日期：2014-10-05;修回日期：2014-12-09