蔣蕓 付浩 馮昌雨 吳劍榮

摘 要：應用不同方法處理紅肉（豬肉與牛肉），研究能夠有效解離紅肉中N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）的預處理方式。將紅肉通過水煮、微波加熱和有機酸腌制等不同方式進行處理，利用酸水解法釋放紅肉中的兩種唾液酸成分Neu5Gc和N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），經1，2-二氨基-4，5-亞甲基二氧苯（1，2-diamino-4，5-methylenedioxybenzene，DMB）衍生化后用高效液相色譜檢測其含量；另外還采用β-半乳糖苷酶水解紅肉，再測定水解液中的Neu5Gc和Neu5Ac。結果表明：沸水浴處理紅肉后其Neu5Gc和Neu5Ac都有一定程度的解離，水煮時間越長，紅肉中Neu5Gc和Neu5Ac解離效果越好，且豬肉中的Neu5Gc相比牛肉的更容易水煮解離。采用微波爐高溫處理紅肉也能夠解離Neu5Gc，但是解離率不超過70.0%，且處理時間影響較?。欢鳱eu5Ac的解離率都低于Neu5Gc。紅肉通過不同的弱有機酸腌制處理后Neu5Gc和Neu5Ac解離率差別不大，且醋酸腌制處理后Neu5Gc解離效果較好。另外，β-半乳糖苷酶能有效解離豬肉中Neu5Gc，水解時間越長，解離率越高。對于牛肉，Neu5Gc解離率最高為84.0%，解離效果不如豬肉。

關鍵詞：紅肉；N-羥乙酰神經氨酸；N-乙酰神經氨酸；唾液酸

Effects of Different Treatments on N-glycolylneuraminic Acid Dissociation in Red Meat

JIANG Yun， FU Hao， FENG Changyu， WU Jianrong*

（Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology， Ministry of Education，

School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Abstract： In this work， different approaches were tested to find the most efficient one to remove n-glycolylneuraminic acid （Neu5Gc） from red meat （pork and beef）. The red meats were treated with cooking in hot water， heating by microwave oven and pickling with organic acid. Then the residual Neu5Gc and N-acetylneuraminic acid （Neu5Ac） in the red meat was liberated with acetic acid and determined by high performance liquid chromatography （HPLC） after 1，2-diamino-4，5-methene-dioxy benzene （DMB） derivatization. In addition， the red meat was hydrolyzed by β-galactosidase and the hydrolysate was determined for Neu5Gc and Neu5Ac. As a result， treatment with boiling water could remove both Neu5Gc and Neu5Ac to some extent. They could be removed more effectively with longer-term treatment by boiling water and the Neu5Gc in pork was easier to remove than that in beef. Microwave heating could also remove the Neu5Gc in red meat， while the dissociation rate was lower than 70.0% and the treatment time had no significant influence. The dissociation rate of Neu5Ac was lower than that of Neu5Gc. After pickling with different organic acids， the dissociation rate of Neu5Gc and Neu5Ac in red meat showed no difference and the treatment with acetic acid could work better for Neu5Gc removal. In addition， hydrolysis by β- galactosidase could remove the Neu5Gc in pork more efficiently. The longer the hydrolysis time was， the higher the dissociation rate of Neu5Gc was. With regard to beef， the highest dissociation rate was only 84.0%， which was lower than that in pork.

Key words： red meat； N-glycolylneuraminic acid； N-acetylneuraminic acid； sialic acid

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）12-0052-06

doi： 10.15922/j.cnki.rlyj.2015.12.010

近年來，肉類的消費在我國迅速增長，尤其是紅肉和加工肉，已經有大量流行病學資料顯示，紅肉及其加工肉類的過多攝入易引發(fā)癌癥[1]，最新流行病學研究發(fā)現，吃紅肉的人群患結腸癌、乳腺癌、冠心病等慢性病的危險性增高[2]。這與紅肉中含有一種特殊的唾液酸成分——N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）密切相關。由于N-羥乙酰神經氨酸的攝入使機體內產生N-羥乙酰神經氨酸的抗體，引起抗原響應和炎癥，進而引發(fā)癌癥[3-4]。已有證據證明，Neu5Gc在結腸癌、成視網膜細胞瘤、乳腺癌和黑色素瘤組織中的水平有所升高[5-10]。但目前關于Neu5Gc引發(fā)癌癥的具體原因并沒有定論。

唾液酸是一類神經氨酸的衍生物，是含有9 個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖[11]，廣泛存在于脊椎動物組織及少數微生物中，通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在[12-13]。唾液酸種類有50多種，主要的

3 種結構為：N-乙酰神經氨酸、N-羥乙酰神經氨酸和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（又名脫氨神經氨酸）（2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid，KDN）[14]。唾液酸的衍生物基本都是上述3種核心成分的乙?；?、巰基化、甲基化、酯化和內酯化產物。

N-乙酰神經氨酸和N-羥乙酰神經氨酸是自然界存在的兩種唾液酸的主要物質，是構成神經節(jié)苷脂中鞘糖脂的主要成分[15]。Neu5Gc常存在于糖蛋白和糖脂的糖基化末端，在大多數后口動物的非神經組織和體液中普遍存在，包括棘皮動物和脊椎動物[16]。大多數哺乳動物，包括與人類相近的類人猿都能自身合成Neu5Gc，但健康人體不能合成[17]。這也從進化上使得人類和其他動物區(qū)別開[18]。也是由于猿猴、黑猩猩、豬等含有較多Neu5Gc，他們的器官如果移植到人體就產生強烈的排異作用。人體內主要的唾液酸形式是Neu5Ac，約占整個唾液酸家族的99%以上，少以游離形式存在，多連接在細胞膜表面的糖蛋白、糖脂或寡糖末端，且其分子結構具有多樣性，參與細胞識別、信號轉導、腫瘤發(fā)生、受精等多個生理過程[19]。

人體能夠合成Neu5Ac，卻不能合成Neu5Gc，人體中Neu5Gc主要是通過食物攝入在體內積累[20-21]。來自于飲食及其他代謝物轉化而來的Neu5Gc可以以糖基復合物的形式出現于上皮細胞或一些癌組織中[22]。Neu5Gc作為人類某些癌癥疾病中的一種特異性標志物[23]，主要作為抗原存在。美國加州大學圣迭戈分校大學教授Varki[24]多年研究發(fā)現作為非人類唾液酸，Neu5Gc的攝入使機體內產生識別Neu5Gc的抗體，促進慢性炎癥發(fā)生，從而刺激腫瘤生長。肉類尤其是紅肉和加工肉類是人體Neu5Gc的重要來源途徑，可使Neu5Gc在體內堆積，增加癌癥的風險[25]。另外紅肉中還含有Neu5Ac，對普通人來說是可有可無的，而孕產婦由于嬰兒發(fā)育或者喂奶[26]，需要大量Neu5Ac，因此我們看到這些婦女經常喝肉湯和骨頭湯。如果有辦法能在烹飪前通過預處理，把部分Neu5Gc解離出去，就能減少發(fā)生癌癥的危險。

不同紅肉中Neu5Gc含量各不相同，并且同種紅肉經過不同方式處理后其含量也不同。美國Varki[27]發(fā)現豬肉中Neu5Gc含量為25.5 μg/g，牛肉中為30.1 μg/g。而Chen等[28]報道豬肉中Neu5Gc含量為5.6 μg/g，牛肉中為30.3 μg/g。到目前為止，研究食物中唾液酸含量的報道較多，但還沒有相關文獻報告通過某種預處理方法可以降低紅肉中的Neu5Gc含量。因此，可以借鑒日常紅肉烹飪方式，采取預處理方式降低Neu5Gc攝入量，從而為人們合理膳食提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉（豬肉和牛肉）均從菜市場購買。

Neu5Ac、Neu5Gc標準品、1，2-二氨基-4，5-亞甲基二氧苯（1，2-diamino-4，5-methylenedioxybenzene，DMB、甲醇、乙腈（色譜純） 美國Sigma公司；硫酸、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Breeze 2型高效液相色譜儀、2475型熒光檢測器 美國Waters公司；InertSustain C18色譜柱 日本島津公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；Amicon Ultra-4/15離心超濾管 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件

色譜柱為InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長373 nm、發(fā)射波長448 nm，流動相為甲醇-乙腈-超純水（7∶8∶85，

V/V），流速為0.9 mL/min，進樣體積10 μL。

DMB衍生液配制：8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰醋酸、0.25 mol/L硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉、0.8 mmol/L 2-巰基乙醇。

衍生條件：90 μL樣品或標準品中加入10 μL DMB衍生液，50 ℃避光衍生150 min，冷卻至室溫后分析。

1.3.2 不同方式處理紅肉樣品

1.3.2.1 弱有機酸結合NaCl腌制處理紅肉

取3 份紅肉，每份1 g切成肉丁，分別加入體積分數為1.5%乳酸溶液、1.5%醋酸溶液、1.5%檸檬酸溶液（各溶液均含0.2 g NaCl）。將樣品放置在冰箱冷藏室中腌制24 h，棄掉腌制液，并用水清洗樣品，以除去樣品中有機酸，得到待測樣品。

1.3.2.2 微波爐加熱處理紅肉

取3 份紅肉，每份1 g切成肉丁，加入10 mL水，在微波爐中分別加熱5、10、15 min。棄掉試管中水，得到待測樣品。

1.3.2.3 水煮加熱處理紅肉

取6 份紅肉，每份1 g切成肉丁，加入10 mL水，在沸水浴中加熱10、20、30、45、60 min。棄掉試管中的水，得到待測樣品。

1.3.2.4 β-半乳糖苷酶水解處理紅肉

取1 g紅肉切成肉丁，加入10 mL水，均質機處理成均勻肉漿，加入1%半乳糖苷酶（以質量分數計），37 ℃恒溫水浴處理不同時間（0.5、1、2、5、10 h），15 000 r/min離心去固形物，上清液用0.45 μm膜過濾，真空干燥，再溶解于1 mL超純水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L

NaOH在37 ℃條件下脫乙酰處理30 min，精確吸取處理后的溶液90 μL，加入10 μL DMB衍生液于50 ℃避光衍生150 min，冷卻后待測。

1.3.3 空白對照中Neu5Gc和Neu5Ac含量的測定

分別取1 g新鮮豬肉和牛肉樣品，按1.3.2節(jié)各種方式處理紅肉空白對照（除β-半乳糖苷酶水解處理紅肉）。加入10 mL 2 mol/L醋酸，均質機處理成肉漿，80 ℃水解3 h，15 000 r/min離心去固形物，上清液用0.45 μm膜過濾，真空干燥除去醋酸，再溶解于1 mL超純水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH在37℃條件下脫乙酰處理30 min。精確吸取處理后的溶液90 μL，加入10 μL DMB衍生液于50 ℃避光衍生150 min，冷卻后待測。

1.3.4 紅肉樣品中Neu5Gc、Neu5Ac解離率測定

經過不同方式處理后紅肉樣品中Neu5Gc、Neu5Ac解離率分別按式（1）、（2）計算：

（1）

（2）

式中：C1、C3分別為空白對照紅肉樣品中Neu5Gc和Neu5Ac的含量/%；C2、C4分別為不同方式預處理后紅肉樣品中Neu5Gc和Neu5Ac的含量/%。

1.3.5 標準品線性實驗

精確稱取0.032 5 g Neu5Gc和0.030 9 g Neu5Ac標準品，分別溶解于100 mL超純水中，配成1 mmol/L Neu5Gc、1 mmol/L Neu5Ac標準品溶液。分別取濃度為1 mmol/L的兩種標準溶液5、10、20、30、40 μL按照表1配成待衍生的混合液，衍生后HPLC檢測，不同濃度標準品進樣2 次。以2 次峰面積的平均值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標繪制標準曲線，計算標準曲線方程。

2 結果與分析

2.1 Neu5Gc、Neu5Ac標準品的液相色譜檢測

2.1.1 Neu5Gc、Neu5Ac標準品色譜圖

利用唾液酸在酸性條件下能與DMB衍生液生成較強熒光信號的DMB衍生物[29]，采用HPLC檢測紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac含量。Neu5Gc、Neu5Ac標準品色譜圖如圖1所示，Neu5Gc的保留時間為12.627 min，Neu5Ac的保留時間為16.150 min，色譜峰分離效果較好。由于熒光對雜質很敏感，因此在實驗過程中對樣品的純度和實驗操作要求較高。

圖 1 Neu5Gc（a）和Neu5Ac（b）標準品溶液的色譜圖

Fig.1 Chromatograms of standard solutions of Neu5Gc （a） and Neu5Ac （b）

2.1.2 線性關系考察

考察測定方法的線性關系，在標準唾液酸的范圍內，Neu5Gc、Neu5Ac標準品濃度（mmol/L）與峰面積具有良好的線性關系：Neu5Gc含量標準曲線為y=0.000 4x+29.554 0，R2=0.995 6；Neu5Ac含量標準曲線為y=0.000 7x+7.5216，R2=0.999 4。

2.2 空白對照中Neu5Gc、Neu5Ac的含量

空白對照中Neu5Gc、Neu5Ac進行HPLC測定，峰面積如圖2所示。按外標法計算其含量，新鮮豬肉中Neu5Gc含量為（35.00±2.41） μg/g，Neu5Ac含量為（110.00±3.10） μg/g；

新鮮牛肉中Neu5Gc含量為（19.00±1.25） μg/g，

Neu5Ac含量為（90.00±2.68） μg/g。

圖 2 豬肉（a）和牛肉（b）空白基質色譜圖

Fig.2 Chromatograms of matrix blank of pork （a） and beef （b）

2.3 不同處理方式對紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離的影響

2.3.1 水煮對紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離的影響

水煮是非常普通的豬肉烹調方式。為探究水煮是否能解離出Neu5Gc，本研究控制紅肉的水煮時間，Neu5Gc、Neu5Ac的解離情況如圖3所示。

a.豬肉；b.牛肉。

圖 3 水煮對紅肉中唾液酸解離的影響

Fig.3 Effect of cooking in hot water on the dissociation of sialic acid in red meat

由圖3可知，隨著水煮時間的延長，紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離率都逐漸增多。豬肉水煮30 min后Neu5Ac解離率變化不大，但Neu5Gc一直呈上升趨勢，并且在60 min解離率高達88.4%；而牛肉中Neu5Gc解離率從水煮處理10 min的58.0%增加到45 min的80.0%，但在45 min后解離率變化不大，Neu5Ac的解離則隨著水煮時間的延長增加比較明顯。因此，水煮時間越長，紅肉中非人類唾液酸Neu5Gc解離越多。但在實際烹調中，水煮處理時間過長也影響肉的營養(yǎng)保留。

2.3.2 微波爐加熱處理對紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離的影響

微波爐是常見的廚房烹調設備。本研究嘗試用微波爐加熱處理紅肉，Neu5Gc、Neu5Ac解離情況如圖4所示。

a.豬肉；b.牛肉。

圖 4 微波爐處理對紅肉中唾液酸解離的影響

Fig.4 Effect of microwave heating on the dissociation of sialic acid in red meat

由圖4可知，微波爐處理和水煮一樣也能解離出Neu5Gc，處理5 min后，Neu5Gc解離率超過50.0%。隨著微波爐加熱時間的延長，豬肉中非人類唾液酸Neu5Gc解離率逐漸增多，但是處理10 min與15 min的Neu5Gc解離率變化不大（70%左右），而Neu5Ac在微波爐加熱時解離率在55.0%～70.0%范圍波動。在牛肉中Neu5Gc解離情況變化不大，但解離率都在70.0%以上，對于Neu5Ac，隨著微波爐加熱時間越長，Neu5Ac解離率增大，但是都低于Neu5Gc的解離率。由于微波爐的加熱原理是通過水分子運動產生熱量，因此處理紅肉時，糖鏈末端的唾液酸可能會受到水分子的攻擊從而脫落下來。

2.3.3 有機酸腌制對紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離的影響

一些有機酸如醋酸、檸檬酸和乳酸是食品飲料中的常見配料。前期研究發(fā)現唾液酸在酸性環(huán)境中容易從糖鏈上解離。為探究不同有機酸對紅肉中唾液酸解離的影響，模擬廚房肉類腌制過程，Neu5Gc、Neu5Ac解離情況如圖5所示。

a.豬肉；b.牛肉。

圖 5 有機酸腌制處理對紅肉中唾液酸解離的影響

Fig.5 Effect of pickling with organic acid on the dissociation of sialic acid in red meat

由圖5可知，豬肉在有機酸腌制的情況下，60.0%以上唾液酸解離出來。其中，醋酸和乳酸對豬肉中Neu5Gc解離效果較好，在檸檬酸處理后，豬肉中Neu5Ac解離率比較大。牛肉通過有機酸腌制后，牛肉中Neu5Gc解離情況變化不大，對于Neu5Ac，醋酸腌制后解離效果最好，其次為乳酸和檸檬酸。在3 種有機酸腌制中，醋酸結合氯化鈉腌制對牛肉中非人類唾液酸Neu5Gc解離效果最好。因此，紅肉在經過有機酸處理后也可以解離部分Neu5Gc，但是，有機酸腌制處理需要放冰箱過夜，處理方法相對時間比較長。

2.3.4 β-半乳糖苷酶處理對紅肉中Neu5Gc、Neu5Ac解離的影響

β-半乳糖苷酶是一種商業(yè)化的食品用酶，可以水解含有半乳糖苷的物質，紅肉中的唾液酸主要連接在半乳糖上。以一定量的β-半乳糖苷酶處理豬肉，解離情況如圖6所示。隨著β-半乳糖苷酶處理時間延長，豬肉中Neu5Gc和Neu5Ac解離率都逐漸增大，說明水解時間越長，豬肉中唾液酸解離出來的越多。在處理10 h后，Neu5Gc和Neu5Ac幾乎完全解離出來。同樣，用β-半乳糖苷酶處理牛肉，牛肉中Neu5Gc和Neu5Ac解離率總體也呈上升趨勢。對于Neu5Gc，水解1 h的解離率反而下降，這可能是酶處理牛肉塊時，由于空間位阻造成的誤差；水解5 h后，Neu5Gc解離率變化較小，在82.0%左右。對于Neu5Ac，水解1 h后其解離率就變化不大。說明相比β-半乳糖苷酶對豬肉中唾液酸解離效果良好，牛肉纖維較大可能不利于酶完全發(fā)揮其作用。

a.豬肉；b.牛肉。

圖 6 β-半乳糖苷酶處理對紅肉中唾液酸解離的影響

Fig.6 Effect of hydrolysis by β-galactosidase on the dissociation of sialic acid in red meat

3 結 論

本研究選擇紅肉中典型的肉類——豬肉和牛肉進行唾液酸含量的檢測。空白對照實驗發(fā)現豬肉中Neu5Gc含量為35.00 μg/g，Neu5Ac為110.00 μg/g；牛肉中Neu5Gc含量為19.00 μg/g，Neu5Ac為90.00 μg/g。牛肉中的Neu5Gc平均含量低于豬肉。

研究了水煮、微波爐加熱、有機酸腌制和半乳糖苷酶水解處理豬肉和牛肉中非人類唾液酸解離的影響。通過不同的加工方式處理紅肉發(fā)現，豬肉水煮時間越長，從豬肉中解離出來的非人類唾液酸Neu5Gc越多，解離率最高達88.4%。而牛肉通過水煮60 min后，Neu5Gc的解離率達到85.0%；紅肉經過微波高溫加熱處理其Neu5Gc的解離效果變化不大，15 min后豬肉中的Neu5Gc解離率為70.0%，而牛肉達到了79.0%。采用不同的有機酸處理發(fā)現，豬肉和牛肉在醋酸中解離效果最好，解離率分別為68.3%和66.7%。β-半乳糖苷酶能有效解離豬肉中Neu5Gc，水解時間越長，解離率越高；對于牛肉，Neu5Gc的解離效果不如豬肉。因此，食用紅肉最好是通過長時間的水煮，盡可能除去紅肉中Neu5Gc的含量。對于豬肉和牛肉進行其他方式的處理（煙熏、風干等）以及其他紅肉的加工處理還需做進一步地探討。

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