杜永慶

[中圖分類號] S858 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2015）10-0167-02

前言：近年來，隨著養(yǎng)雞業(yè)的迅猛發(fā)展，雞大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也不斷增加，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)殖業(yè)的最為危害之一。 目前細菌性疾病的防治主要依靠抗菌素和疫苗制品，但由于細菌血清型差異變化較大、抗菌素長期超大劑量使用、耐藥菌株產(chǎn)生等原因，導(dǎo)致細菌性疾病的防治效果下降，因而在臨床上需不斷選取敏感性藥物才能達到防治細菌性疾病的目的增多腹膜，有灰白色滲出物。目前大腸桿菌對抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，氟苯尼考與多西環(huán)素連用對雞大腸桿菌進行體外抑菌試驗觀察其，聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果，為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 方法

1.1 細菌分離

無菌采集死雞的肝臟，肺臟等組織。接種到普通瓊脂平板上在溫箱中37℃培養(yǎng)20h。涂片革蘭氏染色后鏡檢。挑取表面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明的單個小菌落劃線接種于麥康凱瓊脂平板，于37？℃培養(yǎng)20？h。

1.2 生化試驗

將純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖等生化試驗管內(nèi)37℃培養(yǎng)20h種到普通肉湯當(dāng)中放進溫箱37？℃培養(yǎng)20h，涂片，用革蘭氏染色后鏡檢，挑觀察結(jié)果

1.3 菌液制備

將分離出來菌釣取單個菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)20h放到4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥敏試驗

1.4.1用天枰稱取0.07g氟苯尼考原粉放入小玻璃瓶中用無菌蒸餾水稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.2稱取0.07g多西環(huán)素原粉放入小玻璃瓶中用無菌蒸餾水稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.3稱取氟苯尼考多西環(huán)素各0.07g放入小玻璃瓶中用無菌蒸餾水混勻稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.4將培養(yǎng)皿清洗干凈用牛皮紙包好放在高壓滅菌鍋里滅菌15min，取出后放入干燥箱內(nèi)干燥，放入恒溫箱備用。

1.4.5制作營養(yǎng)瓊脂平板： 稱取蛋白胨10g、牛肉膏5g、Nacl 5g、瓊脂15g、500ml的蒸餾水放入燒杯中，放入微波爐里直至溶解，取出牛皮紙封口用繩扎緊放在高壓鍋內(nèi)滅菌15min。滅菌后取出將瓊脂倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖動使其均勻，瓊脂凝固后涂病料。

1.4.6接種： 取出接種環(huán)燒去多余菌體，待接種環(huán)冷去挑取雞大腸桿菌的單個菌落稍稍打開培養(yǎng)皿從接種細菌的部位從左向右輕輕劃線，劃線完畢皿蓋。在已接完種的平板底壁中心及四周貼上標(biāo)簽寫上藥物名稱，在用鑷子夾取制備好的藥片貼在瓊脂平板的上與所寫藥名的位置對應(yīng)，最后放入恒溫箱中20h后觀察.

藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直勁， 15 mm≤d<20 mm為高敏， 10 mm≤d<15 mm為中敏， d<10 mm為低敏。

2 最小抑菌濃度測定

2.1 氟苯尼考體外抑菌

2.1.1 藥物原液稀釋

用電子天平稱取0.07g藥物，用無水乙醇滴加震蕩至完全溶解，以蒸餾水容到50ml，無菌操作將藥物溶解稀釋1280ug/ml。

2.1.2 稀釋菌液

用營養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋，然后在8支無菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個管中加入稀釋后的菌液1.8ml其余各管均加入1ml。

2.1.3 加入抗菌藥物

做2倍遞進稀釋，將滅菌后的試管放在試管架上進行試驗操作，在第一試管內(nèi)加入抗菌藥物原液0.2ml，混合后用移液管吸出1ml加入第2個試管中，用同樣的方法依次稀釋至第7個試管中棄去1ml。第8管為生長對照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后觀察結(jié)果凡無肉眼可見的細菌生長的最低藥液濃度為該藥單用時的MIC。

2.2 多西環(huán)素體外抑菌

2.2.1 藥物原液稀釋

用電子天平稱取0.08g藥物，用無水乙醇滴加震蕩至完全溶解，以蒸餾水容到50ml，無菌操作將藥物溶解稀釋1280ug/ml。

2.2.2 稀釋菌液

用營養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋，然后在8支無菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個管中加入稀釋后的菌液1.8ml其余各管均加入1ml。

2.2.3 加入抗菌藥物

做2倍遞進稀釋，將滅菌后的試管放在試管架上進行試驗操作，在第一試管內(nèi)加入抗菌藥物原液0.2ml，混合后用移液管吸出1ml加入第2個試管中，用同樣的方法依次稀釋至第7個試管中棄去1ml。第8管為生長對照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后觀察結(jié)果凡無肉眼可見的細菌生長的最低藥液濃度為該藥單用時的MIC。

2.3 聯(lián)合用藥

2.3.1 藥物原液稀釋

分別稱取兩種藥物原粉，用蒸餾水混合定容到50ml。

2.3.2 稀釋菌液

用營養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋，然后在8支無菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個管中加入稀釋后的菌液1.6ml其余各管均加入1ml。

2.3.3 加入抗菌藥物

分別將兩種藥液0.2ml加入第一個試管中，用二倍遞進稀釋法，直到稀釋至第7個試管中棄去1ml。第8管為生長對照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后觀察結(jié)果凡無肉眼可見的細菌生長的最低藥液濃度為該藥單用時的MIC。

3 實驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果： 氟苯尼考對雞大腸桿菌的敏感度比多西環(huán)素敏感度高。聯(lián)合用藥時為高度敏感.氟苯尼考與多西環(huán)素合用對雞大腸桿菌的最小抑菌濃度為1ug/ml表示兩藥合用為累加作用。

4 討論

雞大腸桿菌是一種條件性病原微生物，當(dāng)機體抵抗力下降，特別是應(yīng)急的情況下細菌的致病性即可表現(xiàn)出來使感染的雞發(fā)病。本病常成為某些傳染病的并發(fā)病或繼發(fā)病。

單藥的體外抗菌活性試驗結(jié)果表明，大腸桿菌對氟苯尼考已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性這說明如果在生產(chǎn)中繼續(xù)使用單藥，將很難起到殺菌作用，而且會使細菌耐藥性進一步增強。治療需要，當(dāng)敏感菌低水平耐藥后必須增大用藥劑量，如果用藥不規(guī)范就會造成藥物在體內(nèi)大量蓄積。藥物蓄積濃度越高，細菌產(chǎn)生耐藥性的速度越快，治療時用藥量就越大，這樣就形成惡性循環(huán)，氟苯尼考與多西環(huán)素合用呈累加作用. 兩藥聯(lián)合可大大減少氟苯尼考的用量減少了用藥成本，同時大幅度增強殺菌效果。

藥敏實驗表明氟苯尼考與多西環(huán)素合用對大腸桿菌敏感度為高度敏感。測得單藥的最小抑菌濃度與聯(lián)合用藥的最小抑菌濃度表明，聯(lián)合用藥為累加作用。聯(lián)合用藥組的抑菌作用比單獨用藥高。