蔣福平等

摘要：目的：探討湖南地區(qū)漢族人群中MMP-9基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。方法：在湖南地區(qū)漢族人群中采集169例2型糖尿病患者以及166名正常糖耐量志愿者外周血，提取基因組DNA。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）和DNA直接測(cè)序技術(shù)鑒定MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)的等位基因和基因型，分析等位基因頻率在不同人群中的分布及其與2型糖尿病的相關(guān)性。結(jié)果：MMP-9基因C-1562-T位點(diǎn)等位基因在2型糖尿病和正常糖耐量人群中的分布頻率分別為0.687、0.313和0.589、0.411（P<0.01），糖尿病人群中CC基因型比例顯著高于正常糖耐量人群（P<0.01）。結(jié)論 MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)T等位基因及TT基因型與湖南地區(qū)漢族人群2型糖尿病的易感性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：漢族；MMP-9；2型糖尿??；基因多態(tài)性

【中圖分類號(hào)】R781.6+4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-8602（2015）06-0098-02

前言

糖尿病（diabetes mellitus）是一種長(zhǎng)期的慢性疾病，患者在長(zhǎng)期的高血糖狀況下，機(jī)體代謝發(fā)生紊亂，防御機(jī)制減弱，抗感染能力降低，且多合并微循環(huán)病變[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常見的類型，其特征為胰島素作用異常和分泌障礙，可以任其一個(gè)方面為主，確切病因還不清楚[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9， MMP-9）又稱為明膠酶B，是人類MMPs中分子量最大的酶，MMP-9可通過降解、破壞靠近腫瘤細(xì)胞表面的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）和與基底膜（basement membrane， BM），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移灶形成，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。新近有研究提示MMP-9基因多態(tài)性也與糖尿病及糖尿病的并發(fā)癥有密切關(guān)聯(lián)[4]，為此，本研究擬初步探討MMP-9基因的單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病之間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集我院收治的門診或住院2型糖尿病患者169例作為患者組，均符合WHO 1999年糖尿病的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，排除各種糖尿病急性并發(fā)癥，感染，嚴(yán)重肝、腎功能損害，惡性腫瘤和自身免疫性疾病。其中男性78例，女性91例；平均年齡（55.5±7.7）歲；平均病程（5.44±4.02）年。另采集162例來自我院體檢中心及市中心血站的隨機(jī)無親緣關(guān)系的正常個(gè)體作為對(duì)照組，其中男性72例，女性94例；平均年齡（46.3±9.3）歲。患者組和對(duì)照組所有個(gè)體均為連續(xù)三代以上的湖南籍漢族人。

1.2主要儀器和試劑 人全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶）；Taq DNA polymerase、dNTPMixture、10×PCR buffer、50bp DNA Ladder Marker（北京索萊寶）；瓊脂糖、限制性核酸內(nèi)切酶SPH I（Biotech公司）；PCR引物合成（大連寶生物）。PCR儀（Bio-Rad MyCycler PTC240美國(guó)）；微型水平電泳槽（北京市六一儀器廠，DYY-H128B型）

1.3檢測(cè)方法 采集受試者外周靜脈血5 mL，按試劑盒說明抽提基因組DNA，所得DNA樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其260nm/280nm OD值，檢測(cè)DNA的純度和含量。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5min預(yù)變性，95℃ 45s→69℃ 45s→72℃ 45s（30cycles），72℃ 10min。MMP-9 C-1562-T位點(diǎn)引物：上游：5'-GCCTGGCACArAGTAGGCCC-3'；下游：5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3'。擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物酶切，酶切體系包括：PCR產(chǎn)物 5 μL，SPH I 1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，置37℃過夜。取上述酶切產(chǎn)物5 μL，加入上樣緩沖液1 μL，混勻后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。隨機(jī)抽取20份擴(kuò)增樣本基因測(cè)序（華大基因）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用Students t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料的比較 糖尿病組組與正常對(duì)照組的年齡、性別、BMI無顯著性差異，但患者組的FPG、TG、CHO、VLDL、LDL明顯高于對(duì)照組，而HDL顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05） （表1）。

2.2 MMP-9基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 采用PCR-RFLP及DNA直接測(cè)序技術(shù)能正確鑒定出MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)的等位基因和基因型（圖1，圖2）。

2.3 兩組MMP-9基因多態(tài)性的比較 應(yīng)用上述方法鑒定出所有研究對(duì)象MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)的等位基因和基因型，并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩組MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)的等位基因型CC/CT/TT的分布存在差異，患者組中的CT和TT基因型頻率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；兩組MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)C-1562-T位點(diǎn)等位基因C/T的分布存在差異，患者組中T基因頻率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）（表2）。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，2型糖尿?。═ype 2 Diabetes， T2D）的發(fā)病率明顯增加，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。胰島素抵抗（insulin resistance， IR）和葡萄糖刺激的胰島素分泌 （glucose stimulated insulin secretion， GSIS）受損是導(dǎo)致T2D發(fā)展的2個(gè)主要因素[5]。新近研究顯示認(rèn)為T2D是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展與的炎癥反應(yīng)以及胰島中的血管損傷密切相關(guān)[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）一類活性依賴于Zn2+的和Ca2+的內(nèi)肽酶超家族，可由體內(nèi)多種細(xì)胞合成和分泌，它可以降解除多糖外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分、促進(jìn)細(xì)胞增殖、新生血管形成和組織重塑等，參與體內(nèi)多種病理生理過程。

國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)MMP-9的表達(dá)水平和活性變化與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者合并腎損害時(shí)血漿中MMP-9的水平升高，并發(fā)生于微量白蛋白尿之前，認(rèn)為可作為DN的早期診斷指標(biāo)。但隨著尿蛋白排泄率的增加MMP-9逐漸減低，MMP-9/TIMP比值呈遞減趨勢(shì)，細(xì)胞外基質(zhì)膠原降解逐漸減少，導(dǎo)致腎小球基底膜的增厚及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，形成了糖尿病腎病的典型病理改變[8]。本研究采用PCR-RFLP和 DNA測(cè)序法檢測(cè)了162例正常對(duì)照和169例T2D患者的MMP-9基因C-1562-T位點(diǎn)的等位基因和基因型分布。結(jié)果顯示T2D患者組中C-1562-T位點(diǎn)T堿基出現(xiàn)頻率顯著高于正常對(duì)照組，這強(qiáng)烈提示1562-T突變與T2D的易感性相關(guān)。

糖尿病及其慢性并發(fā)癥是一種遺傳基因和內(nèi)外環(huán)境綜合作用而形成的多種病理過程參與的復(fù)雜的綜合征。同一基因不同位點(diǎn)或序列的變異可能導(dǎo)致不同的影響，并且在不同的代謝因素、不同的組織器官中其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)可能也有差異[9]。而MMP的活性變化對(duì)其不同的并發(fā)癥的病理過程有不同的影響。例如在糖尿病腎病的治療上，則需要根據(jù)其不同的發(fā)展階段中MMP的活性不同變化選擇MMP抑制或激活劑，而且在治療動(dòng)脈粥樣硬化中過度抑制或激活MMPs活性均不利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。從本研究對(duì)MMP-9基因C-1562-T位點(diǎn)的分析結(jié)果出發(fā)，我們認(rèn)為TT基因型和T等位基因是2型糖尿病的易感基因，而CC基因型和C等位基因是其保護(hù)性基因，以此為基礎(chǔ)，仍需一步更為深入的研究，以探索基因之間，基因與內(nèi)外環(huán)境因素之間，基因與組織器官之間復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，揭開2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展規(guī)律。

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