湯曉 朱建華 童燕

摘 要： 利用超聲輔助技術提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，并利用HPLC法進行定性定量分析。結果表明，當乙醇體積分數為65%，液料比為15∶1，提取時間為45 min時，總黃酮的提取率最高；紅豆杉針葉中的黃酮類化合物以苷類為主，尤其是槲皮素苷類。

關鍵詞： 紅豆杉； 針葉； 黃酮類化合物； 超聲輔助提?。?HPLC

中圖分類號： R 284.2 文獻標志碼： A 文章編號： 1671-2153（2015）06-0102-03

0 引 言

紅豆杉是世界公認的天然珍稀抗癌植物，它的根、皮、枝、葉等部位中含有紫杉醇、紫杉烷類等化合物，具有良好的抗癌效果[1]，亦含有二萜類、黃酮類、揮發(fā)油等其他組分[2]。

紫杉醇等成分多存在于根皮中，但由于紅豆杉生長緩慢，因此，如果只開發(fā)利用根皮易造成紅豆杉資源匱乏。與根皮相比，針葉中的有效成分也較多，且可以不斷生長，從而實現(xiàn)植物的循環(huán)利用。研究表明，黃酮類化合物具有多種生理活性[3]，而它們往往富集于葉片中，可幫助植物免受紫外線損害[4]，因此，如能從黃酮類的角度開發(fā)利用紅豆杉針葉資源，則能達到保護與開發(fā)該植物的雙重作用。本研究旨在提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，并對其進行鑒定，以期更好地開發(fā)利用紅豆杉針葉資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

紅豆杉取自寧波慈城妙山，采摘后的紅豆杉針葉，經干燥后，粉碎處理（80目篩）。

1.2 儀器與試劑

752N型紫外-可見分光光度計，超聲清洗器，數顯恒溫水浴鍋，LC-20AT高效液相色譜儀。

蘆丁、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素、金絲桃苷、芹菜素標準品為色譜純（純度>98%），乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 總黃酮的超聲提取工藝優(yōu)化

稱取干燥后的紅豆杉針葉粉末10 g，分別加入一定體積分數的乙醇和一定液料比（體積質量比）的水溶液冷浸30 min，再利用超聲輔助提取一定時間，提取溫度為40℃，提取兩次，合并提取液。依次優(yōu)化乙醇體積分數、液料比及超聲提取時間。

1.3.2 總黃酮的質量分數測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進行測定，測定波長為510nm，以蘆丁標準品作標準曲線[5]。

1.3.3 總黃酮的結構鑒定

最佳超聲輔助提取工藝下的總黃酮提取液，經旋轉蒸發(fā)儀50 ℃蒸發(fā)濃縮至干后，進行HPLC檢測[6]。

色譜柱為C18（150 mm×6.0 mm， 5 μm）；流速為1.0 mL/min；波長為360 nm；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL。流動相A為水/乙腈/甲酸（87/3/10），流動相B為乙腈；進樣量20 μL。

采用梯度洗脫：0～45 min，3%～25%B相；46 min，30%B相；47 min，3%B相。

2 結果與分析

2.1 總黃酮提取的最佳乙醇體積分數

乙醇體積分數的單因素實驗結果如圖1所示。

由圖1可以看出，當用體積分數為65%的乙醇水溶液超聲提取紅豆杉針葉中的總黃酮時，總黃酮的提取率最高。這表明，紅豆杉針葉中的黃酮類化合物可能為中等極性。

2.2 總黃酮提取的最佳乙醇液料比

液料比的單因素實驗結果如圖2所示（此時乙醇體積分數為65%）。

由圖2可以看出，當液料比為15∶1時，紅豆杉針葉中的總黃酮提取率最高。這表明，此時紅豆杉細胞內外的總黃酮質量分數可能已達到平衡，因此，繼續(xù)增加液料比時，總黃酮提取率不再增加。

2.3 總黃酮提取的最佳提取時間

超聲提取時間的單因素實驗結果如圖3所示（此時乙醇體積分數為65%，液料比為15∶1）。

由圖3可以看出，當提取時間為45 min時，紅豆杉針葉中的總黃酮提取率最高。這表明，此時紅豆杉細胞內外的總黃酮質量分數可能已達到平衡，因此，繼續(xù)增加提取時間，黃酮類化合物不再被浸出。

2.4 紅豆杉針葉中黃酮類化合物的鑒定結果

利用體積分數為65%乙醇水溶液再次超聲輔助提取紅豆杉針葉中的總黃酮，液料比為15∶1，提取時間為45 min。提取液中的黃酮類化合物HPLC定性定量分析結果分別如圖4及表1所示。

HPLC鑒定結果顯示，紅豆杉針葉中含有8種黃酮類化合物，其中以苷類為主（6種），尤其是槲皮素苷類（4種），而質量濃度最高的為山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷。紅豆杉針葉中測得的游離黃酮類化合物僅有槲皮素與芹菜素，且質量濃度較低。

3 結果與討論

超聲輔助提取作為一種現(xiàn)代技術，具有縮短提取時間、節(jié)約能源、節(jié)省溶劑用量、避免高溫破壞提取物結構等多種優(yōu)點，超聲波輻射所產生的強烈空化應效應、機械振動、擾動效應可顯著提高有效成分的提取率[7]。有學者利用超聲波技術提取了紅豆杉枝葉中的總黃酮，并進行了工藝優(yōu)化[8]。但是，由于紅豆杉品種的差異，以及枝葉與針葉中黃酮類化合物的種類差異等因素，本研究的超聲提取最佳工藝條件并不同于他人的研究。此外，由于本研究的目的著重在于分析紅豆杉針葉中所存在的黃酮類化合物種類及其含量，以期為后期開發(fā)利用該植物奠定基礎，因此，并未對提取工藝做進一步的探討（提取方法及工藝參數的深入優(yōu)化）。

紅豆杉針葉中的黃酮類化合物以苷類（尤其是槲皮素苷類）為主，這表明，如同其他植物[4]，紅豆杉針葉亦需要槲皮素苷類等有效成分幫助其抵抗紫外線輻射等外界氧化因素。但是，紅豆杉針葉中的游離黃酮類化合物并不多，推測針葉中的黃酮類化合物在其生物代謝途徑中，游離的黃酮類可能結合了植物中的糖類，代謝成苷類，以便更好地發(fā)揮此類有效成分的抗氧化作用。

紅豆杉針葉中含有多種黃酮苷類，開發(fā)利用針葉資源可起到保護紅豆杉資源的作用。利用超聲輔助提取法可有效提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，提取工藝條件的優(yōu)化值得進一步研究探討。

參考文獻：

[1] 衛(wèi)強，張國升，劉金旗，等. 紅豆杉枝葉中化學成分及含量研究進展[J]. 廣州化工，2014，42（6）：17-23.

[2] 曾慧英，謝建春，盧立晃，等. 南方紅豆杉葉揮發(fā)性成分[J]. 精細化工，2011，28（11）：1112-1116.

[3] CONFORTI F，SOSA S，MARRELLI M，et al. The protective ability of mediterranean dietary plants against the oxidative damage：the role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol，flavonoid and sterol contents[J]. Food Chemistry，2009，112（3）：587-594.

[4] 湯曉，邱從平，賈娟，等. 加拿大一枝黃花黃酮成分的動態(tài)分析[J]. 浙江農業(yè)學報，2011，23（5）：961-966.

[5] 黃澤元，王海濱，劉志偉. 芝麻葉中總黃酮的最佳提取工藝研究[J]. 農業(yè)工程學報，2004，20（6）：201-204.

[6] 湯曉，倪翠陽，王麗英，等. 煮制時間與二次煮制對紫娟普洱茶抗氧化性的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（8）：141-147.

[7] 張貴明，王繼文，王文澤，等. 朝鮮產東北紅豆杉樹皮中多糖提取工藝的比較研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2008，10（6）：32-34.

[8] 衛(wèi)強，張國升，劉金旗，等. 皖南地區(qū)紅豆杉枝葉中總黃酮的超聲波提取工藝研究[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34（11）：886-889.

Abstract： The flavonoids in needles of Taxus Mairei were extracted by ultrasonic assisted technology. HPLC was used for qualitative and quantitative analysis of these flavonoids. The results showed that when 65% ethanol was used for 45 min of extraction under 15：1 of liquid-solid ratio， the total flavonoids extraction rate was the highest. The major flavonoids in needles of Taxus Mairei were glycosides， especially quercetin glycosides.

Key words： Taxus Mairei； needles； flavonoids； ultrasonic assisted extraction； HPLC

（責任編輯：徐興華）