高偉偉 霍香如 李桂霞 韋永可 朱杰

摘 要：研究不同溫度和時(shí)間條件處理對(duì)雞爪筋膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響。加熱組將新鮮雞爪筋剪碎勻漿后分別在50、60、70℃條件下水浴加熱10、20、30min；凍藏組將新鮮雞爪筋分別在-20、-80℃條件下凍藏5、10、15d，通過(guò)對(duì)處理后的樣品采用原子力顯微鏡掃描成像的方法研究雞爪筋在不同溫度及時(shí)間處理后的膠原纖維周期長(zhǎng)度和粗糙度的變化。結(jié)果表明：膠原纖維周期隨加熱溫度升高、加熱時(shí)間增長(zhǎng)而變短，隨凍藏溫度降低，凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而變長(zhǎng)，其中60、-20℃變化最典型。60℃時(shí)，當(dāng)加熱時(shí)間由10min增至30min，周期長(zhǎng)度由（72.20±2.58）nm減至（71.00±1.78）nm；-20℃時(shí)，當(dāng)凍藏時(shí)長(zhǎng)由5d增至15d，周期長(zhǎng)度由（69.70±2.60）nm增至（73.00±2.90）nm。凍藏時(shí)間增加，雞爪筋膠原纖維表面的粗糙度增加；加熱時(shí)間增加，50℃加熱時(shí)，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先增后減；60℃加熱與之相反。

關(guān)鍵詞：原子力顯微鏡；加熱；凍藏；雞爪；膠原纖維；超微結(jié)構(gòu)

Effects of Heating and Frozen Storage on Ultrastructure of Collagen Fibers from Chicken Claw

GAO Weiwei1， HUO Xiangru1， LI Guixia1， WEI Yongke1， ZHU Jie1，2，*

（1. Laboratory of Biomechanics and Engineering， Institute of Biophysics， College of Science， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. Sino-US Joint Center of Food Safety， Northwest A&F University， Yangling， 712100， China）

Abstract： The main objective of this study was to explore the effects of different temperatures and treatment times on ultrastructure of collagen fibers from chicken claw. In the heated group， fresh samples were heated in water of 50， 60 and70 for 10， 20 and 30 minutes respectively； in the frozen group， samples were frozen in ?20 and ?80 ℃ for 5，10 and 15 days respectively. By scanning the samples via atomic force microscopes， the experiment was intended to examine the changes in D-spacing length and roughness of collagen fiber under different treatments. The results show that with the heating temperature rising and processing time becoming longer， the D-spacing length of collagen fiber grew shorter， and it grew longer when the frozen temperature decreased and storage time was extended. Samples at 60 and ?20 ℃ showed the most significant changes. At 60 ℃， D-spacing length reduced from72.20 to 71.00 nm （n =10） with processing time increasing from 10 to 30 min； at ?20 ℃， it increased from 69.70 to 73.00 nm （n =10） as storage time increased from 5 to 15 days.With the frozen time increasing， the surface roughness of collagen fibers from chicken claw increased. At 50 ℃， with the heating time increasing， the roughness increase firstly and then decrease. The contrary changes in roughness change were observed for heating at 60 ℃.

Key words：atomic force microscope； heating； frozen storage； chicken claw； collagen fiber； ultrastructure

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

雞爪是肉雞宰殺后的一種副產(chǎn)品，近年來(lái)以雞爪為原材料開發(fā)的產(chǎn)品深受歡迎，如鹵雞爪、炸雞爪、泡雞爪等[1]。熱處理是一種常見的肉制品熟化和殺菌方法，不同熱處理方式和溫度對(duì)雞爪品質(zhì)有顯著的影響[2]。肉在加熱過(guò)程中發(fā)生了大量的物理和生化反應(yīng)，諸多品質(zhì)也隨之變化顯著[3]，其中膠原蛋白的變化尤為重要。加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)的熱變性是引起膠原蛋白構(gòu)造變化的主要原因[4]。

由于雞爪是富含膠原的食品，因此具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較好的口感。但雞爪在高溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易變味[5]，所以需要進(jìn)行凍藏保藏。低溫貯藏作為食品的主要保鮮方法[6]，廣泛應(yīng)用于各種食品的保鮮，膠原蛋白與肉的質(zhì)地口感有很大相關(guān)性，因此，研究膠原蛋白在低溫貯藏下的變化對(duì)于保證肉的質(zhì)地口感有著重要意義。經(jīng)研究，膠原蛋白在凍藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生降解[7]，溶解性的改變會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)的改變。并且現(xiàn)有研究認(rèn)為，提高凍藏速率和降低貯藏溫度能夠提高肉的質(zhì)量[8-9]。

無(wú)論采用哪種處理技術(shù)，往往都要通過(guò)檢測(cè)膠原纖維結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性來(lái)反映最終的處理效果。Binnig等[10]發(fā)明的原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）放大倍數(shù)（109倍）遠(yuǎn)超以往的任何顯微鏡[11]，AFM是一種具有原子級(jí)高分辨的新型儀器[12]，既能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞與生物大分子的納米級(jí)分辨成像，又能實(shí)現(xiàn)微觀局部力學(xué)特性的檢測(cè)，非常適合膠原纖維納米結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性的研究。

本研究通過(guò)對(duì)雞爪筋進(jìn)行不同時(shí)間的加熱和凍藏處理，經(jīng)剪碎、勻漿、離心后制樣，用原子力顯微鏡掃描膠原纖維的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律以及總體纖維形態(tài)的分布，找到溫度及作用時(shí)間對(duì)雞爪筋的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞爪購(gòu)于楊凌高新農(nóng)業(yè)示范區(qū)康樂(lè)市場(chǎng)。將新鮮雞爪解剖取出其內(nèi)部筋腱，蒸餾水清洗，分割成1.5cm的小段，每一段作為一個(gè)樣品用量。

1.2 儀器與設(shè)備

Multimode-8型（Nanoscope V）原子力顯微鏡、SCANASYST-AIR型探針（探針材料為氮化硅）、微懸臂（T=650nm、L=115μm、W=25μm、f0=70kHz、k=0.4N/m）美國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

加熱組：將分割后的筋用剪刀剪碎，裝于10mL玻璃管中，在50、60、70℃條件下分別進(jìn)行水浴加熱10、20、30min，將加熱后的雞爪筋腱在勻漿機(jī)下間歇?jiǎng)驖{直到雞爪筋腱被打散，然后用離心機(jī)在3000r/min下離心2次，每次2 min，除去部分可溶性雜質(zhì)，最后將得到的樣品加1.5mL蒸餾水混勻。用移液槍吸取20μL點(diǎn)樣于新鮮解理的云母片，室溫晾干后用移液槍吸取蒸餾水逐滴沖洗樣品，將沖洗過(guò)后的云母片用雙面膠粘在金屬臺(tái)上，于原子力顯微鏡下掃樣成像[13]。

凍藏組：分割好的筋腱于-20、-80℃條件下分別凍藏5、10、15d，將凍藏到期的雞爪筋腱取出后用剪刀機(jī)械剪碎，后續(xù)步驟同加熱組。

1.3.2 AFM成像[14-17]

所有測(cè)試均在原子力顯微鏡上完成。AFM采集樣品表面信息通過(guò)一端裝有該探針的微懸臂完成。當(dāng)針尖與樣品接近時(shí)，此AFM可以通過(guò)ScanAsyst智能成像模式，對(duì)樣品進(jìn)行圖像采集。

1.4數(shù)據(jù)處理

將原子力顯微鏡掃描得到的高度圖，使用軟件NanoScope Analysis（Version 1.10）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[18-19]。實(shí)驗(yàn)測(cè)定周期長(zhǎng)度（D）、均方根（Rms）、Rz（在一個(gè)取樣長(zhǎng)度內(nèi)，5個(gè)最大輪廓峰高之和與5個(gè)最大輪廓谷深之和的差值的平均值）的相關(guān)數(shù)據(jù)，并用Excel整理數(shù)據(jù)，分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱和凍藏處理后雞爪筋膠原纖維周期變化

A.加熱溫度50 ℃；B.加熱溫度60℃；C.加熱溫度70℃；下腳標(biāo)1～3.加熱時(shí)間分別為10、20、30 min。

圖1不同加熱溫度和處理時(shí)間對(duì)膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig. 1 Ultrastructure of collagen fibers at different heating temperatures and processing times

由圖1可知，經(jīng)不同時(shí)間和溫度處理后的雞爪筋的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，經(jīng)AFM掃描可發(fā)現(xiàn)雞爪筋表面的膠原纖維周期結(jié)構(gòu)和粗糙度都有改變。加熱組隨著加熱時(shí)長(zhǎng)和溫度的增加，膠原纖維的周期結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，未經(jīng)任何處理的膠原纖維周期為（72.40±2.74）nm。50℃加熱時(shí)，加熱10、20、30min后膠原纖維的周期長(zhǎng)度分別為（72.30±1.63）、（72.20±0.83）、（71.80±1.19）nm；60℃加熱時(shí)，加熱10、20、30min后膠原纖維的周期長(zhǎng)度分別為（72.20±2.58）、（71.70±3.46）、（71.00±1.78）nm；70℃加熱10min后，周期長(zhǎng)度為（71.10±3.90）nm。70℃加熱20、30min，膠原纖維結(jié)構(gòu)已被嚴(yán)重破壞，整體纖維分布不再規(guī)則，已經(jīng)明膠化。

A.凍藏溫度-20℃；B.凍藏溫度-80℃；下腳標(biāo)1～3.加熱時(shí)間分別為5、10、15d。

圖2 不同凍藏溫度和處理時(shí)間對(duì)膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig. 2 Ultrastructure of collagen fibers at different frozen temperatures and storage times

由圖2可知，-20℃凍藏時(shí)，凍藏5、10、15d后膠原纖維的周期長(zhǎng)度分別為（69.70±2.60）、（71.70±1.50）、（73.00±2.90）nm；-80℃凍藏時(shí)，凍藏5、10、15d后膠原纖維的周期長(zhǎng)度分別為（69.80±2.90）、（71.40±2.40）、（72.00±1.60）nm。

圖3 加熱（A）與凍藏（B）過(guò)程中膠原纖維周期長(zhǎng)度的變化規(guī)律

Fig. 3 Changes in D-spacing length of collagen fibers during heating （A） and freezing （B）

由圖3可知，相同加熱溫度下，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，膠原纖維的周期長(zhǎng)度越短；相同加熱時(shí)間，加熱溫度越高，膠原纖維的周期長(zhǎng)度越短。相同凍藏溫度下，凍藏時(shí)間越長(zhǎng)，膠原纖維的周期長(zhǎng)度越長(zhǎng)；相同凍藏時(shí)間，凍藏溫度越低，膠原纖維周期長(zhǎng)度越短。

2.2 加熱和凍藏處理后雞爪筋膠原纖維粗糙度變化

2.2.1 凍藏組Rz、Rms變化

圖4 凍藏組Rz（A）和Rms（B）的變化規(guī)律

Fig. 4 Changes of Rz（A） and Rms（B） among frozen groups

由圖4可知，隨著凍藏時(shí)間的不斷增加，-20℃和-80℃凍藏的雞爪筋膠原纖維的Rz、Rms值均呈現(xiàn)規(guī)律性變化。凍藏時(shí)間越長(zhǎng)，Rz、Rms值越大。-20℃凍藏5、10、15d膠原纖維的Rz值分別為（4.28±0.72）、（5.55±0.15）、（5.64±0.30）nm；Rms值分別為（1.97±0.33）、（2.31±0.22）、（3.01±0.16）nm。-80℃凍藏5、10、15d膠原纖維的Rz值分別為（4.79±0.70）、（5.11±0.41）、（5.58±0.80）nm；Rms值分別為（2.54±0.58）、（2.66±0.44）、（2.93±0.57）nm。Rz和Rms的增加說(shuō)明，隨著凍藏時(shí)間的增加，雞爪筋膠原纖維表面的粗糙度增加。

2.2.2加熱組Rz、Rms變化

圖5 加熱組Rz（A）和Rms（B）變化規(guī)律

Fig. 5 Changes in Rz（A） and Rms（B） during heating

由圖5可知，50℃和60℃加熱條件下膠原纖維的Rz、Rms值呈現(xiàn)相同變化規(guī)律。50℃加熱10、20、30min膠原纖維的Rz值分別為（1.70±0.15）、（5.58±0.27）、（4.51±0.22）nm；Rms值分別為（0.87±0.00）、（2.47±0.141）、（2.20±0.45）nm。60℃加熱10、20、30min膠原纖維的Rz值分別為（5.90±0.67）、（5.46±0.15）、（6.57±0.30）nm；Rms值分別為（2.42±0. 23）、（2.31±0.06）nm、（2.45±0.13）nm。50℃加熱時(shí)，隨著加熱時(shí)間的增加，雞爪筋膠原纖維樣品的Rz、Rms的參數(shù)值都是先上升后下降；60℃加熱時(shí)，隨著加熱時(shí)間的增加，雞爪筋膠原纖維樣品的Rz、Rms的參數(shù)值都是先下降后上升。Rz和Rms的變化趨勢(shì)說(shuō)明：50℃加熱時(shí)，隨加熱時(shí)間的增加，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先增加后減小；60℃加熱時(shí)，隨加熱時(shí)間的增加，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先減小后增加。

3 結(jié)論

用AFM對(duì)加熱和凍藏處理后的雞爪膠原纖維進(jìn)行清晰的成像，從而對(duì)不同處理?xiàng)l件下雞爪膠原纖維的周期長(zhǎng)度進(jìn)行了界定，并通過(guò)分析同一溫度不同時(shí)長(zhǎng)的處理結(jié)果得知，在雞爪膠原纖維的加熱過(guò)程中，膠原纖維發(fā)生了皺縮形變致使膠原纖維的周期縮短；而在凍藏過(guò)程中，膠原纖維則發(fā)生了拉伸形變致使周期增長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)已基本得出加熱與凍藏過(guò)程對(duì)雞爪膠原纖維周期長(zhǎng)度的影響。凍藏組的Rz和Rms的變化說(shuō)明，凍藏處理的時(shí)間越長(zhǎng)，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度增大；加熱組中50℃加熱時(shí)，隨著加熱處理的時(shí)間變長(zhǎng)，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度先增大后減??；60℃加熱時(shí)，隨著加熱處理時(shí)間變長(zhǎng)，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度先減小后增大。

AFM在數(shù)據(jù)處理上存在一定的不足，主要表現(xiàn)在樣品或空氣中的污染物質(zhì)會(huì)在探針和樣品相互作用時(shí)粘附到探針上，從而在AFM成像時(shí)對(duì)膠原纖維樣品表面形態(tài)的測(cè)量產(chǎn)生干擾[20]，影響數(shù)據(jù)的分析，使誤差增大。但相比其他傳統(tǒng)的雞爪筋膠原纖維的顯微圖片，AFM的顯微系統(tǒng)對(duì)于加熱及凍藏處理后雞爪筋膠原纖維的形變可以進(jìn)行更好的量化處理，這使得此次實(shí)驗(yàn)處理具有更好的直觀性。同時(shí)，AFM技術(shù)及其輔助技術(shù)分辨率在側(cè)向上可達(dá)到0.1nm，豎直方向上可達(dá)到0.01nm[21]，這也提高了此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，該技術(shù)為肉品質(zhì)的評(píng)測(cè)及微觀測(cè)量技術(shù)提供了極有用的方向及指導(dǎo)。

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