乞素冬，王晶晶，張小龍，沈霏，李琦涵，李艷艷，劉龍丁，和占龍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118

·論著·

柯薩奇病毒A16在恒河猴外周血單個核細(xì)胞中的增殖研究

乞素冬＊，王晶晶＊，張小龍，沈霏，李琦涵，李艷艷，劉龍丁，和占龍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118

柯薩奇病毒A16（CA16）感染靈長類動物模型顯示該病毒在猴體內(nèi)可形成明顯的病毒血癥期，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析病毒血癥形成與CA16在外周血單個核細(xì)胞（PBMC）不同組分中增殖的關(guān)系。首先用CA16感染恒河猴，檢測病毒在PBMC組分CD4＋、CD8＋、CD20＋、CD11c＋、CD16＋和CD14＋細(xì)胞中的增殖情況和感染動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)病毒僅在部分CD14＋細(xì)胞中有增殖表現(xiàn)。然后通過刺激CD14＋細(xì)胞產(chǎn)生一定量的樹突細(xì)胞（DC），用CA16感染DC，發(fā)現(xiàn)CA16能在DC中形成具有動力學(xué)意義的增殖過程，增殖峰值出現(xiàn)在感染后12～36 h。這些結(jié)果可能為CA16感染發(fā)病機(jī)制提供重要信息。

柯薩奇病毒A16；恒河猴；外周血單個核細(xì)胞；感染；增殖動力學(xué)

以人腸道病毒71型（enterovirus type 71，EV71）和柯薩奇病毒A16（Coxsackievirus A16，CA16）為主要病原的兒童手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）［1，2］，是近年來在亞洲和太平洋地區(qū)出現(xiàn)的大規(guī)模流行的病毒性傳染?。?］。作為一個已受公眾關(guān)注的傳染病，其主要臨床病理特征是患兒的手足口部皰疹及相應(yīng)的類似感冒癥狀［4］，其中1%～2%可發(fā)展成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為特征的重癥病例［5］，主要為EV71感染［6］，而大多數(shù)CA16感染病例表現(xiàn)為特征性的皰疹及發(fā)熱［7］，這一臨床病理機(jī)制尚不清楚。本課題組在探索CA16感染靈長類動物模型時發(fā)現(xiàn)，CA16感染引起的特征性病理表現(xiàn)過程與EV71感染過程類似［8］，即經(jīng)歷一個明顯的病毒血癥期?；谶@一結(jié)果，本課題組初步分析了CA16感染恒河猴外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）及血液中不同成分的基本特征，為進(jìn)一步探討CA16感染的病理機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒實(shí)驗(yàn)所用Vero細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室保存；CA16分離自2010年廣西壯族自治區(qū)HFMD患者咽拭子，經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器試劑有Ficoll-Paque PREMIUM（GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）；CD4＋、CD8＋、CD16＋、CD20＋和CD14＋抗體（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，Logan，UT，USA）；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）（Peprotech，NJ，USA）；CD83、CD86、CD40、人白細(xì)胞抗原DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）；QIAmp Viral RNA mini Kit（Qiagen，Germany）；One Step PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa，Japan）。0.22 μm濾器購自Millipore（Bedford，MA）。儀器有FACSArill、CantoⅡ（BD，San Jose，CA，USA）及7500 PCR儀（ABI，USA）。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離與培養(yǎng)將所采集的HFMD患兒咽拭子經(jīng)無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋，用0.22μm濾器過濾除菌后接種于含MEM培養(yǎng)基的Vero細(xì)胞中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）后收獲樣品。將Vero細(xì)胞培養(yǎng)至單層后，將感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1的病毒接種至細(xì)胞，待顯微鏡下出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒感染性滴度檢測將所培養(yǎng)的病毒液按10倍梯度稀釋，于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔10μl，每個稀釋度接種8孔。每孔加入Vero細(xì)胞懸液100μl（密度為2×105個細(xì)胞／孔），于37℃培養(yǎng)至第7天時觀察病變情況，將細(xì)胞病變＞50%判為陽性，以Karber公式計算感染性滴度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)用恒河猴及病毒感染方法經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：SCXK［滇］2011-0005），在實(shí)驗(yàn)開始前2周選取2～3歲、體重2.0～2.5 kg的健康恒河猴6只，隔離飼養(yǎng)，采集血樣檢測CA16抗體，確保所有實(shí)驗(yàn)猴CA16抗體均為陰性。其中4只經(jīng)鼻腔噴霧途徑感染CA16，感染劑量為4.5 lgCCID50／ml（每只鼻腔噴霧1 ml）；另外2只設(shè)為對照，每只PBS鼻腔噴霧1 ml。于感染后的第1、3、5、7、9、14天共收集4 ml乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetate，EDTA）抗凝全血，其中200μl用于PBMC分離和病毒核酸提取，剩余血樣用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 PBMC的分離與淋巴細(xì)胞分選將剩余EDTA抗凝全血約3.8 ml，經(jīng)Ficoll-Paque PREMIUM密度離心分離出PBMC，臺酚藍(lán)染色、計數(shù)。將計數(shù)后的細(xì)胞用磁珠分離技術(shù)分選出CD4＋、CD8＋、CD16＋、CD20＋和CD14＋細(xì)胞，并結(jié)合BD流式細(xì)胞儀分選HLA-DR＋細(xì)胞。將細(xì)胞密度調(diào)整至1× 105個／孔，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。同時以陰性猴PBMC為對照。自培養(yǎng)開始每隔24 h收集細(xì)胞，并收集密度離心后的血漿、紅細(xì)胞和單核細(xì)胞，于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 病毒接種與培養(yǎng)將部分篩選后含不同表面分子的細(xì)胞按1×105個／孔培養(yǎng)于含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，接種0.1 MOI CA16，連續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔12 h收集樣品，以Vero細(xì)胞為對照。

1.2.6 樹突細(xì)胞的培養(yǎng)將經(jīng)磁珠分選的CD14＋細(xì)胞按1×105個／孔培養(yǎng)于含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，加入20 ng／ml GM-CSF和10ng／ml IL-4培養(yǎng)4 d，加入10 ng／ml TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集細(xì)胞；通過標(biāo)記CD83、CD86、CD40和HLA-DR抗體，用流式細(xì)胞術(shù)檢測樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）誘導(dǎo)情況。同時以未經(jīng)CD14分選的PBMC及陰性猴PBMC為對照。自培養(yǎng)起每隔24 h收集細(xì)胞，用于進(jìn)一步監(jiān)測病毒在體內(nèi)的增殖情況。

1.2.7 病毒載量檢測將收集的樣品包括200μl EDTA抗凝血及經(jīng)Ficoll-Paque PREMIUM密度離心后的血漿、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和上述相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按Qiagen試劑盒說明書提取核酸，定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）按TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank中注冊的CA16 VP1序列保守區(qū)（注冊號：JN590244）設(shè)計特異性引物和探針，引物序列為F1：5′-CAACCCATCTGTGTTTGTGAAAA-3′；R1：5′-GGTATGCACTAGCTGGTGACATG-3′；P1：5′-（FAM）CCGCCAGCTCAAGTGCAGTCCC（TAM）-3′。同時將密度分別為105、104、103、102、101、100、10－1拷貝／μl的CA16 RNA標(biāo)準(zhǔn)品加入同一反應(yīng)板中進(jìn)行PCR。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以mean±SD表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果

2.1 CA16在PBMC中增殖導(dǎo)致病毒血癥

對CA16感染恒河猴全血進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示病毒血癥的出現(xiàn)主要在感染后第5～7天，病毒出現(xiàn)的高峰是感染后第5天，最高病毒載量可達(dá)260拷貝／ml（圖1A），與以前對其他腸道病毒如EV71的研究結(jié)果類似［8］，也與文獻(xiàn)報道的脊髓灰質(zhì)炎病毒感染特性相似［9］。另外，對外周血的不同組分，包括PBMC、血漿、紅細(xì)胞及血小板進(jìn)行分離并檢測，結(jié)果顯示病毒主要存在于PBMC中，病毒載量在第5天達(dá)400拷貝／105個細(xì)胞（圖1B），這與全血中病毒出現(xiàn)的時間基本吻合。雖然PBMC中病毒拷貝數(shù)略高，但仍在同一數(shù)量級上。其他組分經(jīng)統(tǒng)計比較沒有差異（圖1B）。這一結(jié)果提示，CA16在PBMC中增殖可能是病毒血癥的主要原因。

圖1 CA16感染恒河猴引起的病毒血癥Fig.1 Dynamic distribution of CA16in infected rhesus monkey

2.2 CA16感染淋巴細(xì)胞的檢測

基于對CA16感染恒河猴后病毒載量的分析，進(jìn)一步探索CA16在PBMC中的主要增殖細(xì)胞。在PBMC相關(guān)淋巴細(xì)胞的篩選過程中，用猴CD4和CD8抗體經(jīng)磁珠分選后獲得CD4＋和CD8＋細(xì)胞，對這2種細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示與未感染對照組相比，CD4＋和CD8＋細(xì)胞中不存在CA16核酸（圖2A）。用同樣方法從正常恒河猴外周血中分離CD4＋、CD8＋和CD20＋細(xì)胞，進(jìn)行CA16體外感染，病毒增殖過程分析表明CA16不感染CD4＋、CD8＋及CD20＋細(xì)胞（圖2B）。結(jié)果提示，在恒河猴PBMC中，T細(xì)胞不是CA16感染的靶細(xì)胞。同時，用抗CD20抗體檢測從恒河猴PBMC中分離的B細(xì)胞，結(jié)果顯示B細(xì)胞也不是CA16感染的敏感細(xì)胞，而作為對照的Vero細(xì)胞則有明顯的病毒擴(kuò)增趨勢（圖2B）。

圖2 CA16感染T和B細(xì)胞的分析Fig.2 Viral loads in lymphocytes from the blood of infected rhesus monkeys

2.3 CA16感染中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的動力學(xué)分析

鑒于CA16對T、B細(xì)胞不敏感，本研究用CD16和CD14抗體磁珠分離技術(shù)分離恒河猴感染CA16后第1、3、5天PBMC中自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK細(xì)胞）的主要表面抗原CD16＋群體和單核細(xì)胞主要表面抗原CD14＋群體，檢測病毒RNA基因。結(jié)果顯示，NK細(xì)胞中CA16基因檢測基本為陰性（圖3A），而用CD14抗體分離的單核細(xì)胞中可見病毒載量輕度升高，病毒拷貝數(shù)在感染后第3天開始上升，均值高于100拷貝／105個細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，用同樣分離方法分離正常恒河猴的CD16＋和CD14＋細(xì)胞，體外感染CA16，檢測病毒增殖情況。結(jié)果顯示，病毒感染CD14＋細(xì)胞后12～48 h可見病毒基因拷貝數(shù)輕度上升，而NK細(xì)胞仍為陰性（圖3B）。此外，由于CD14也是部分DC的表面抗原，故進(jìn)一步用抗HLA-DR抗體對CD14細(xì)胞分選，發(fā)現(xiàn)篩選后的細(xì)胞在CA16感染過程中病毒未增殖（圖3C）。這些結(jié)果似乎提示，CA16可在部分CD14＋細(xì)胞中增殖。

圖3 CA16在CD14＋和CD16＋細(xì)胞中的增殖情況Fig.3 CA16 can be propagated in the proliferation of CD14＋and CD16＋cells

2.4 CA16對DC的感染分析

基于CA16僅對少量CD14＋細(xì)胞感染的觀察，本研究對同樣能表達(dá)CD14的DC進(jìn)行檢測。首先，為準(zhǔn)確分離DC，將來自正常恒河猴的PBMC經(jīng)IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)并經(jīng)TNF-α刺激后，用CD83、CD86、CD40和HLA-DR抗體來確定是否培養(yǎng)成功。結(jié)果顯示，恒河猴PBMC經(jīng)適當(dāng)刺激物刺激后，部分PBMC可刺激分化成DC（圖4A）。在這些DC中進(jìn)行CA16感染動力學(xué)分析，同時以PBMC和Vero細(xì)胞組為對照（圖4B）。結(jié)果顯示，CA16在24 h內(nèi)即可快速感染PBMC，但很快病毒載量檢測恢復(fù)為陰性。這段時間內(nèi)病毒拷貝數(shù)值較低，均值約為100拷貝／105個細(xì)胞。病毒能在DC中形成具有動力學(xué)意義的增殖過程，出現(xiàn)峰值的時間為12～36 h，病毒載量均值為100～200拷貝／105個細(xì)胞，60 h后降至陰性。Vero細(xì)胞對照組則與前期研究相似，表現(xiàn)出典型的增殖動力學(xué)過程。

圖4 CA16在DC中增殖的動態(tài)狀況Fig.4 Dynamic profile of CA16 proliferation in DCs in vitro

3 討論

CA16作為引起兒童HFMD的主要病原之一，盡管所致臨床病理結(jié)果比EV71輕［10］，但其較高的發(fā)病率和典型的手足口皰疹等臨床特征具有明顯的公共衛(wèi)生意義［9］。因此，對其病理機(jī)制的認(rèn)識，將有助于臨床治療及疫苗預(yù)防相關(guān)研究。由于有關(guān)CA16感染的病理分析大多來源于嚙齒類動物實(shí)驗(yàn)［11］，而嚙齒類動物作為CA16疫苗的動物模型存在一定的不足［12］，因此本研究探討了CA16感染非人靈長類動物并將其作為致病機(jī)制研究模型的可能性。這些實(shí)驗(yàn)在一些臨床觀察的基礎(chǔ)上［13］，均提示CA16在感染恒河猴后可引起典型的病毒血癥，即機(jī)體感染病毒后3～5 d內(nèi)病毒可能以人們尚不清楚的方式開始增殖，至第7天時逐漸完成增殖過程。這一過程是否與人類感染CA16后所表現(xiàn)的相關(guān)臨床癥狀有一定關(guān)系，需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床研究的支持。本研究顯示這一病毒血癥的形成與病毒在PBMC某一群體中的增殖相關(guān)。進(jìn)一步探討CA16在PBMC群體中增殖的具體細(xì)胞載體，結(jié)果提示CA16主要增殖于DC，包括表面表達(dá)CD14＋的DC；而在其他PBMC群體中，包括T、B細(xì)胞，NK細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，CA16均沒有明顯增殖。這一現(xiàn)象為更深入認(rèn)識CA16感染的病理機(jī)制提供了線索。

DC作為攝取入侵微生物的重要細(xì)胞，能通過抗原呈遞而激活免疫系統(tǒng)中引起特異性免疫的功能細(xì)胞［14］，具有控制免疫系統(tǒng)對入侵微生物產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)或無效免疫反應(yīng)，甚至異常免疫反應(yīng)的重要意義。而具有這一重要調(diào)控能力的細(xì)胞在CA16感染過程中可能出現(xiàn)的反應(yīng)，很可能就包括了病毒感染過程的具體病理性因素。由此著手深入研究，有可能為研究CA16感染的發(fā)病機(jī)制提供重要參考。

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Study on proliferation of Coxsackievirus A16-infected peripheral blood mononuclear cells in rhesus monkeys

QI Su-Dong＊，WANG Jing-Jing＊，ZHANG Xiao-Long，SHEN Fei，LI Qi-Han，LI Yan-Yan，LIU Long-Ding，HE Zhan-Long
Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medicine Science／Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research ＆Development on Severe Infectious Disease，Kunming 650118，China

Previous study suggested that primate animal model infected by Coxsackievirus A16（CA16）can display a significant viremia phase.This study was conducted for further analyzing the relationship between viremia and viral proliferation in peripheral blood mononuclear cell（PBMC）population.Firstly，the rhesus monkeys infected with CA16 were detected for the viral loads in CD4＋，CD8＋，CD20＋，CD11c＋，CD16＋and CD14＋cells from the PBMCs at different infectious stages，and the results revealed that CA16 could only propagate in some CD14＋cells.Secondly，in the dendritic cells（DCs）derived from CD14＋cells induced by granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF）and interleukin 4（IL-4），a significant viral proliferation dynamics could be observed with a viral load peak at 12-36 h post-infection（hpi）.These findings will likely provide important information on the pathogenesis of CA16 infection.

Coxsackievirus A16；Rhesus monkey；Peripheral blood mononuclear cell；Infection；Proliferation dynamics

HE Zhan－Long，E－mail：hzl＠imbcam.com.cn

2014－11－18）

云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品生物重大科技專項(xiàng)（生物疫苗）（2012ZA009），“十二五”國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09102042001），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2013FZ142）

和占龍

＊同為第一作者